组成图示
示意图生成中
传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
L-半胱氨酸（L-cysteine, Cys）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）；样品基质：磷酸盐缓冲液，以及血浆/血清/尿液等生物样品（应用）
检测原理
该传感器以固定化 HRP 为催化识别元件，以 4-TBC 为电化学介体。在 FIA 系统中，含 H2O2 和 4-TBC 的试剂流经旋转 APCG 盘时，HRP 催化 H2O2 将 4-TBC 氧化为醌。无 Cys/GSH 时，醌在 GCE 的 -150 mV 处被还原，产生较大的还原电流。当 Cys 或 GSH 存在时，其游离巯基与醌发生 Michael 加成，生成硫代醌衍生物，消耗可被 GCE 还原的醌，使还原电流下降；ΔI 与硫醇浓度成正比。旋转盘降低扩散层厚度、增强酶表面传质，提高电流和灵敏度；停流/连续流程序实现在线混合与检测。信号放大主要来自 HRP 催化循环、旋转传质增强和低体积高浓度介体。
检测灵敏度
LOD: Cys 0.7 nM；GSH 0.3 nM；线性范围: Cys 0.05–90 μM；GSH 0.04–90 μM；灵敏度斜率: Cys 0.474 μA/μM；相关系数: Cys r = 0.998；GSH r = 0.999
效应效果
FIA 中每小时最多处理 25 个样品。GSSG、胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和尿酸基本无干扰；10 μM 抗坏血酸仅使还原电流下降约 4%，对 GSH 干扰可忽略，对 Cys 可用标准加入法消除，回收率 100.4%。重复测定 10 μM Cys（n=5）标准误差 <4%。连续使用约 3 h，8 个样品后电流几乎无衰减；固定化 HRP 至少稳定 1 个月。未与 ELISA/HPLC/qPCR 直接对比，但作者认为比先前生物传感器更敏感，可用于血浆/全血中极低 Cys/GSH 快速、低成本定量。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：玻璃碳电极（GCE）作为工作电极，置于旋转盘上方，在 -150 mV 检测醌/儿茶酚还原电流；参比电极为 Ag/AgCl（3.0 M NaCl），辅助电极为 Pt 线。
- 旋转盘载体：特氟龙（Teflon）圆盘内嵌微型磁力搅拌棒，承载固定化酶并旋转以增强传质。
- 多孔玻璃修饰层：3-氨基丙基修饰可控孔玻璃（APCG），提供氨基和比表面积，用于固定 HRP。
- 交联/固定层：戊二醛（glutaraldehyde）与 APCG 氨基反应生成醛基，再共价偶联 HRP。
- 识别/催化元件：辣根过氧化物酶（HRP, EC 1.11.1.7），催化 H2O2 氧化 4-叔丁基儿茶酚（4-TBC）生成醌。
- 信号介体：4-叔丁基儿茶酚（4-TBC）作为可逆氧化还原指示剂，被氧化为醌后在 GCE 上还原产生电流。
- 辅底物：过氧化氢（H2O2）作为 HRP 催化氧化 4-TBC 的共底物。
- 流动注射读出单元：FIA 管路、蠕动泵和停流/连续流程序，用于样品引入、反应混合与电流记录。
中文摘要
本文报道了一种用于在线测定半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）的酶促旋转电化学生物传感器，并将其与连续流/停流/连续流流动注射系统联用。辣根过氧化物酶（HRP）固定化在旋转圆盘上，在过氧化氢（H2O2）存在下催化儿茶酚类介体氧化；生成的醌在玻璃碳电极（GCE）表面于 -150 mV 处发生反向电化学还原并被安培检测。当溶液中加入 Cys 或 GSH 时，其巯基与醌发生 Michael 加成，生成相应硫代醌衍生物，使还原峰电流随硫醇浓度增加而成比例下降。以 Cys 为模型硫化合物，在 pH 7 附近获得最高响应。该方法可在 0.05–90 μM 范围内测定 Cys（r=0.998），在 0.04–90 μM 范围内测定 GSH（r=0.999），检测限分别为 0.7 和 0.3 nM，每小时最多可处理 25 个样品。传感器电流不受 GSSG、胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等干扰，抗坏血酸和尿酸等易氧化物质干扰较低。
英文摘要
The high sensitivity that can be attained using an enzymatic system and mediated by catechols has been verified by on-line interfacing of a rotating biosensor and continuous flow/stopped-flow/continuous-flow processing. Horseradish peroxidase, HRP, [EC 1.11.1.7], immobilized on a rotating disk, in presence of hydrogen peroxide catalyzed the oxidation of catechols, whose back electrochemical reduction was detected on glassy carbon electrode surface at -150mV. Thus, when l-cysteine (Cys) or glutathione (GSH) was added to the solution, these thiol-containing compounds participate in Michael addition reactions with catechols to form the corresponding thioquinone derivatives, decreasing the peak current obtained proportionally to the increase of its concentration. Cys was used as the model thiol-containing compound for the study. The highest response for Cys was obtained around pH 7. This method could be used to determine Cys concentration in the range 0.05-90muM (r=0.998) and GSH concentration in the range 0.04-90muM (r=0.999). The determination of Cys and GSH were possible with a limit of detection of 0.7 and 0.3nM, respectively, in the processing of as many as 25 samples per hour. Current response of the HRP-rotating biosensor is not affected by the oxidized form of GSH and Cys (glutathione disulfide, GSSG, and l-cystine, respectively), by sulfur-containing and alkyl-amino compounds such as methionine and lysine, respectively. The interferences from easily oxidizable species such as ascorbic acid and uric acid are lowest.