组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
Abl-T315I蛋白酪氨酸激酶活性（Abl1-T315I kinase activity）；样品基质为体外HEPES磷酸化反应缓冲液（60 mM HEPES，pH 7.5，含MgCl2、MnCl2、Na3VO4、ATP-S）；同时可监测小分子抑制剂staurosporine的抑制作用。
检测原理
生物素化底物肽biotin-EGIYDVP经生物素–链霉亲和素作用固定在APTES/生物素-NHS修饰的ITO电极上。加入Abl-T315I和ATP-S后，激酶将ATP-S的γ-硫代磷酸基团转移到肽的酪氨酸残基，生成硫代磷酸化肽。硫代磷酸化肽与Au NPs结合，使金颗粒在电极表面富集。随后在0.1 M HCl中，Au NPs于1.20 V被氧化为[AuCl4]−，表面生物分子变性，[AuCl4]−在约0.4 V被还原，SWV还原峰电流与Au NPs数量成正比，从而反映激酶活性。加入staurosporine抑制硫代磷酸化时，Au NPs减少，电流下降。
检测灵敏度
LOD: 10 ng/mL（Abl-T315I活性）；Abl-T315I信号在>100 ng/mL饱和；线性范围: 10–500 μM（biotin-EGIYDVP底物肽浓度）。
效应效果
传感器对Abl-T315I选择性良好：非特异性PKC底物肽biotin-SIYRRGSRRWRKL响应可忽略，目标/非目标肽t检验P<0.005。250 μM目标肽四次测量χ²=1.388、P=0.71，t检验P=0.14–0.23，重复性良好；各条件n=3。反应2 h后信号饱和。Lineweaver–Burk得Km=0.672 mM、Vmax=6.73 pmol min−1 μg−1，与放射性标记文献一致。500 nM staurosporine使电流下降50%，>1 μM信号可忽略，与文献Ki=620 nM相符。作者认为可用于体外激酶谱分析和小分子抑制剂高通量筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：ITO玻璃工作电极（indium tin oxide, ITO，电阻率8–12 Ω），提供电化学测量界面。
- 氨基硅烷修饰层：APTES（(3-aminopropyl)triethoxysilane）10% v/v水溶液浸渍并120 °C烘烤，在ITO表面引入氨基。
- 生物素化层：biotin-NHS（biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester）10 μM，与APTES氨基共价连接，提供生物素结合位点。
- 链霉亲和素固定层：streptavidin 10 μM，结合生物素并固定生物素化底物肽；Tween-20（1.0% w/v）封闭游离位点。
- 识别/底物层：biotin-EGIYDVP（生物素化Abl-T315I特异性底物肽），作为PTK催化硫代磷酸化的底物。
- 酶促反应层：Abl-T315I（蛋白酪氨酸激酶）与ATP-S（adenosine 5′-[γ-thio] triphosphate）共底物，催化肽的硫代磷酸化。
- 纳米信号标记层：Au NPs（20 nm胶体金纳米颗粒，A525=0.5），通过硫代磷酸化肽在表面富集，作为电化学信号放大元件。
- 电化学读出介质：0.1 M HCl（pH 2）提供Cl−，Ag/AgCl参比电极与Pt对电极；Au NPs在1.20 V氧化为[AuCl4]−并在约0.4 V还原产生电流。
中文摘要
本文报道了一种基于金纳米颗粒（Au NPs）的电化学生物传感器，用于监测蛋白酪氨酸激酶（PTK）催化的肽磷酸化反应。在肽修饰的氧化铟锡（ITO）电极上，以腺苷5′-[γ-硫]三磷酸（ATP-S）作为共底物进行硫代磷酸化。肽被硫代磷酸化后，Au NPs在电极表面富集，并通过监测Au NP表面的Cl−氧化/还原进行电化学检测。作者以与慢性髓系白血病（CML）治疗相关的临床重要激酶Abl-T315I为模型，结合其高特异性底物肽EGIYDVP测定激酶活性，电化学检测Abl-T315I活性的检出限为10 ng/mL。通过优化传感器性能，并利用非特异性肽修饰电极进行对照实验，证实了方法的选择性。基于Cl−氧化化学获得的电化学电流响应还可用于监测小分子抑制剂staurosporine对硫代磷酸化反应的抑制。
英文摘要
Protein tyrosine kinase (PTK)-catalysed phosphorylation reactions of peptides are monitored electrochemically in the presence of Au nanoparticles (NPs) on peptide modified indium tin-oxide (ITO) electrodes. The method is based on the thiophosphorylation using adenosine 5'-[gamma-thio] triphosphate (ATP-S) as the co-substrate. Upon thiophosphorylation of the peptides, the Au NPs accumulate on the surface and can be detected electrochemically by monitoring Cl(-) oxidation at the Au NP surface. The activity of a clinically important PTK, Abl-T315I, which is implicated in the therapy of chronic myelogenous leukaemia (CML), is determined. Abl-T315I was assayed in combination with its highly specific substrate peptide EGIYDVP. The detection limit for the electrochemical detection of Abl-T315I activity was 10ng/mL. The performance of the biosensor was optimized and control experiment using non-specific peptide-modified electrodes were carried out. The electrochemical current response obtained from the Cl(-) oxidation chemistry enabled monitoring the inhibition of the thiophosphorylation reactions using staurosporine, a small molecule inhibitor.