组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
DNA损伤（styrene oxide-DNA adducts）、咪唑（imidazole）、咪唑-4-乙酸（imidazole-4-acetic acid）、sulconazole（sulconazole nitrate）；样品基质：10 mM sodium acetate pH 5.5/50 mM NaCl孵育液与50 mM NaH2PO4 pH 7.0/50 mM NaCl检测液
检测原理
传感器以PG电极为换能器，PDDA/DNA/CYP101薄膜提供识别与信号界面。孵育时，H2O2激活CYP101，将苯乙烯催化氧化为苯乙烯氧化物；苯乙烯氧化物与DNA鸟嘌呤形成加合物，造成DNA局部凸起或结构松弛，使Ru(bpy)3^2+更接近鸟嘌呤并发生电催化氧化，SWV峰电流增大。以损伤峰电流与背景峰电流之比IpF/IpI对时间作图，初始斜率代表DNA损伤速率。加入咪唑类抑制剂后，抑制剂通过咪唑环N3位与CYP101血红素铁结合，竞争底物结合位点，并可能清除苯乙烯氧化物/活性氧，从而降低加合物形成和初始速率。基于Michaelis-Menten模型拟合初始速率-抑制剂浓度关系，得到表观抑制常数KI*。
检测灵敏度
相关系数：R^2 = 0.98（0 µM imidazole初始速率线性拟合）；R^2 = 0.96（简单竞争拟合，imidazole）；R^2 = 0.98（简单竞争拟合，imidazole-4-acetic acid）；R^2 = 0.92（简单竞争拟合，sulconazole）
效应效果
该传感器抗干扰性良好：仅含抑制剂时无电化学贡献；4-甲基-2-苯基咪唑因2/4位取代几乎不抑制，说明响应依赖咪唑N3位与CYP101血红素铁结合及/或对苯乙烯氧化物的清除。液相色谱确认500 µM抑制剂降低苯乙烯氧化物生成，验证抑制发生在酶活性位点。重现性以n=3标准差表示，如无抑制剂初始速率0.142 ± 0.013 min^-1，Km* 2.6 ± 0.5 mM，Vm* 0.176 ± 0.006 min^-1。摘要报告简单竞争模型KI*为268.2、142.3和204.2 µM，咪唑-4-乙酸最低，为最佳抑制剂。作者认为该传感器可用于药物-药物相互作用快速筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器：热解石墨电极（PG），提供电子转导与电化学检测界面
- 聚电解质修饰层：聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA），通过层-by-layer组装固定DNA与CYP101
- 识别/催化元件：细菌细胞色素P450cam（CYP101），催化苯乙烯生成苯乙烯氧化物
- 识别/信号元件：双链鲑鱼精DNA（st-DNA），与苯乙烯氧化物形成加合物并产生局部结构变化
- 电化学介质：三(2,2'-联吡啶)钌(II)（Ru(bpy)3^2+，Ru(bpy)3Cl2），介导受损DNA的电催化氧化
- 反应启动剂：过氧化氢（H2O2），激活CYP101代谢苯乙烯
- 孵育缓冲液：10 mM sodium acetate pH 5.5/50 mM NaCl，用于CYP101代谢苯乙烯孵育
- 检测缓冲液：50 mM NaH2PO4 pH 7.0/50 mM NaCl，维持电化学检测环境
中文摘要
代谢酶抑制研究对药物开发和毒性评价至关重要，可用于限制或预防由细胞色素P450（cyt P450）等酶产生的有害代谢物。本文评估酶/DNA毒性生物传感器作为研究酶抑制工具的应用。作者以热解石墨（PG）电极上组装的DNA/酶薄膜为传感界面，利用三(2,2'-联吡啶)钌(II)（Ru(bpy)3^2+）介导的DNA氧化电化学信号，监测细菌细胞色素P450cam（CYP101）代谢苯乙烯造成的DNA损伤。苯乙烯代谢由过氧化氢启动，并在咪唑、咪唑-4-乙酸和sulconazole等微摩尔浓度抑制剂存在下进行，以观察DNA损伤抑制。DNA损伤初始速率随抑制剂浓度增加而下降。采用Michaelis-Menten抑制模型的线性与非线性拟合确定表观抑制常数（KI*），并通过比较相关系数与误差平方和（SSE）判断最佳拟合模型。结果证实该酶/DNA生物传感器适用于代谢抑制研究；简单竞争抑制模型最符合咪唑、咪唑-4-乙酸和sulconazole的数据，KI*分别为268.2、142.3和204.2 µM。
英文摘要
Studies of metabolic enzyme inhibition are necessary in drug development and toxicity investigations as potential tools to limit or prevent appearance of deleterious metabolites formed, for example, by cytochrome (cyt) P450 enzymes. In this paper, we evaluate the use of enzyme/DNA toxicity biosensors as tools to investigate enzyme inhibition. We have examined DNA damage due to cyt P450cam metabolism of styrene using DNA/enzyme films on pyrolytic graphite (PG) electrodes monitored via Ru(bpy)(3)(2+)-mediated DNA oxidation. Styrene metabolism initiated by hydrogen peroxide was evaluated with and without the inhibitors, imidazole, imidazole-4-acetic acid, and sulconazole (in micromolar range) to monitor DNA damage inhibition. The initial rates of DNA damage decreased with increased inhibitor concentrations. Linear and nonlinear fits of Michaelis-Menten inhibition models were used to determine apparent inhibition constants (K(I)*) for the inhibitors. Elucidation of the best fitting inhibition model was achieved by comparing correlation coefficients and the sum of the square of the errors (SSE) from each inhibition model. Results confirmed the utility of the enzyme/DNA biosensor for metabolic inhibition studies. A simple competitive inhibition model best approximated the data for imidazole, imidazole-4-acetic acid and sulconazole with K(I)* of 268.2, 142.3, and 204.2 microM, respectively.