组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）；样品基质：磷酸盐缓冲液（实验检测体系），拟用于食品/谷物/花生等受污染样品
检测原理
AFB1可逆结合电鳗乙酰胆碱酯酶（Ee-AChE）活性位点峡谷入口的外周阴离子位点（PAS），形成空间位阻，阻止乙酰硫代胆碱（ATCh）进入催化位点，并阻碍产物排出，使酶催化水解速率下降。ATCh被Ee-AChE水解生成硫代胆碱（thiocholine）；硫代胆碱被电极表面钴酞菁（Co-Pc）介体氧化，介体在+100 mV（vs Ag/AgCl）再氧化产生安培电流。无AFB1时电流较高；AFB1浓度升高，酶活抑制增强，硫代胆碱生成减少，电流下降。该传感器以20%电流/酶活抑制作为检出判据，未使用HCR、RCA等信号放大策略。
检测灵敏度
LOD: 3 μM（对应20%抑制）；最佳酶量: 0.3 mU；最佳底物浓度: 0.5 mM ATCh
效应效果
该传感器以安培电流下降反映AFB1对Ee-AChE的抑制，LOD为3 μM（约1 mg/L），对应20%抑制；最佳固定酶量0.3 mU、ATCh 0.5 mM。稳定性通过连续加入固定量底物、至少三次电流一致确认；测量至少重复两次。Ee-AChE对AFB1最敏感（Kip 0.35 μM），人丁酰胆碱酯酶在100 μM AFB1下无抑制，W321A突变体在<10 μM无抑制，表明外周位点结合决定抑制。作者指出灵敏度低于食品法规限量（如欧盟谷物/花生2 ppb），需从约0.5 kg样品提取并浓缩至1 mL以下，未来可通过酶突变提高灵敏度，用于现场检测，替代ELISA或色谱法。
传感器的构成
- 工作电极：未指明具体基底材料，作为安培换能器
- 介体修饰层：钴酞菁（Co-Pc），介导电子转移并氧化硫代胆碱
- 固定化基质：聚乙烯醇（PVA），与酶1:1混合后氖光聚合固定酶
- 识别元件：电鳗乙酰胆碱酯酶（Ee-AChE），催化水解ATCh并被AFB1抑制
- 信号底物：乙酰硫代胆碱（ATCh，0.5 mM），水解生成硫代胆碱
- 反应介质：100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7），维持酶活与离子环境
- 参考电极：Ag/AgCl伪参比电极，提供+100 mV电位
- 信号读出：恒电位仪（potentiostat）与记录仪，采集电流
中文摘要
本文研究了黄曲霉毒素B1对不同种类胆碱酯酶的抑制作用，以阐明其作用机制。通过分析多种胆碱酯酶突变体的抑制曲线（由酶活性的光谱法测定获得，即pS曲线）表明，该毒素通过结合位于活性位点峡谷入口的外周位点可逆性抑制胆碱酯酶，而不进入位点内部。电鳗酶表现出最高的抑制程度，结合常数估计为0.35 μM。该结合阻止底物进入催化位点，并降低催化位点反应中的化学步骤：乙酰化降低一半，去乙酰化降低至三分之一。电鳗乙酰胆碱酯酶被用于建立安培生物传感器。在电极上使用0.3 mU酶并在溶液中使用0.5 mM ATCh时获得最佳检测。检出限为3 μM，对应20%抑制。
英文摘要
In this paper, the inhibition effect of aflatoxin B1 on different species of cholinesterases was investigated to unravel action mechanism. The inhibition curves of several cholinesterase mutants (obtained by spectrophotometric measurements of enzyme activity, pS curves) were analyzed. They showed that this toxin reversibly inhibits cholinesterases by binding to a peripheral site located at the entrance of the active site gorge without entering inside the site. Electric eel enzyme revealed the highest inhibition extent with a binding constant estimated to 0.35 microM. This binding prevents the entrance of substrate en route to the catalytic site and also decreases chemical steps of the reaction at the catalytic site: acetylation is reduced to the half and deacetylation is reduced to the third. Electric eel acetylcholinesterase was used to settle an amperometric biosensor. The best detection was obtained by using 0.3 mU enzyme on the electrode and 0.5mM ATCh in the solution. The limit of detection was 3 microM corresponding to 20% inhibition.