组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
互补单链DNA（complementary ssDNA, target S2，HBV相关寡核苷酸）；样品基质：Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）杂交，0.1 M PBS（pH 6.5）检测
检测原理
4-ATP通过硫-金相互作用在金电极表面形成自组装单分子层，再经低温盐酸/亚硝酸钠处理原位重氮化，生成diazo-ATP功能膜。氨基修饰探针ssDNA（S1）与重氮基团发生重氮化-偶联，共价固定于电极表面。目标互补ssDNA（S2）与S1杂交形成dsDNA，使电极界面由单链DNA转变为双链DNA结构。[Co(phen)3]3+对dsDNA具有特异性亲和力，结合或嵌入dsDNA后在界面形成可电活性复合物。diazo-ATP层具有优异导电性，可促进[Co(phen)3]3+/2+电子转移，因此DPV峰电流随S2浓度升高而增大；EIS中电子转移电阻也随界面组装和指示剂结合发生变化。该体系未使用酶催化或核酸扩增，信号增强主要依赖共价固定、导电界面和指示剂对dsDNA的特异性结合。
检测灵敏度
LOD: 3.26 × 10−10 M；线性范围: 1.57 × 10−9 to 4.52 × 10−7 M；R^2 = 0.9981；灵敏度斜率: 4.532 A/M（Δip = 4.532C + 1.016 × 10−8，C: M，Δip: A）
效应效果
传感器对互补ssDNA S2产生显著DPV响应，对四碱基错配ssDNA S3仅出现轻微信号变化，表明其具有良好选择性。DPV测量中三次重复平均峰电流与S2浓度在1.57×10^-9至4.52×10^-7 M范围内线性相关，相关系数为0.9981。电极可通过95 ℃热去离子水冲洗5 min并冰浴快速冷却实现再生；经12次杂交/再生循环后仍保留91.9%的初始电流响应，显示可重复使用能力。作者指出，与既往HBV DNA检测工作相比，该传感器线性范围更宽、检出限更低，这归因于探针共价固定和diazo-ATP优异导电性。该方法为DNA分析和生物传感器构建提供了简便、通用平台。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），经抛光、王水/电化学清洗，作为工作电极与电子换能器
- 自组装修饰层：4-氨基硫酚（4-aminothiophenol, 4-ATP）自组装单分子层（SAM），通过硫-Au相互作用稳定修饰金表面
- 重氮化功能层：重氮化4-ATP（diazo-ATP）膜，由4-ATP在0.1 M HCl/NaNO2低温重氮化形成，提供共价偶联位点并增强电子传导
- 识别元件：氨基修饰单链DNA探针（NH2-ssDNA, S1），通过重氮化-偶联共价固定于diazo-ATP表面，用于识别互补ssDNA
- 信号标记物：三(1,10-菲啰啉)钴(III)高氯酸盐（[Co(phen)3]3+），特异性结合/嵌入双链DNA（dsDNA），作为电化学指示剂
- 支持电解质：0.1 M PBS（pH 6.5），用于差分脉冲伏安法（DPV）和循环伏安法（CV）检测
- 阻抗介质：1 mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6加0.1 M KCl，用于电化学阻抗谱（EIS）界面表征
- 清洗/再生介质：HAc-NaAc缓冲液（pH 5.5）、Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）及热去离子水（DDW），用于去除非特异吸附和电极再生
中文摘要
本文报道一种基于4-氨基硫酚自组装单分子层重氮化-偶联共价固定探针DNA的电化学生物传感器新策略。4-氨基硫酚（4-ATP）通过硫-金相互作用在金电极表面稳定自组装，随后在低温盐酸/亚硝酸钠条件下原位重氮化，形成重氮化ATP（diazo-ATP）功能膜。该膜不仅可提供与氨基修饰单链DNA探针（NH2-ssDNA, S1）共价偶联的活性位点，而且具有优异电子传导能力。互补单链DNA（S2）与固定探针杂交后，利用差分脉冲伏安法检测与双链DNA特异性结合的三(1,10-菲啰啉)钴(III)指示剂[Co(phen)3]3+。传感器对目标ssDNA的线性范围为1.57×10^-9至4.52×10^-7 M，检出限为3.26×10^-10 M，具有良好选择性并可再生。该策略为DNA固定和生物传感器构建提供了简便通用平台。
英文摘要
A novel and simple strategy for fabricating of DNA electrochemical biosensor was developed based on covalent coupling of probe NH(2)-ssDNA (S(1)) on Au electrode that had been functionalized by diazotization of assembled 4-aminothiophenol (4-ATP) monolayer. The thiol group of 4-ATP allowed the stable assembly of 4-ATP monolayer. The following diazotization reaction was directly performed to prepare functional diazo-ATP film for covalent coupling of probe S(1). Remarkably, it was noting that the diazo-ATP provided a surface with high conductibility for electron transfer. The complementary ssDNA was determined by using differential pulse voltammetry. The linear range of the developed biosensor was from 1.57 x 10(-9) to 4.52 x 10(-7)M with a detection limit of 3.26 x 10(-10)M. The fabricated biosensor possessed good selectivity and could be regenerated. The covalent immobilization of probe S(1) by simple diazotization-coupling on self-assembled 4-ATP monolayer could serve as a versatile platform for DNA immobilization and biosensors fabricating.