组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
肉毒神经毒素A类毒素（Botulinum neurotoxin type A toxoid, BoNT/A）；样品基质：缓冲液/溶液标准品（非实际生物基质）
检测原理
传感器采用溶液相识别：双标记适配体与BoNT/A在含15 mM KCl的缓冲液中孵育，K+促进G-四联体折叠与高亲和结合。未结合时适配体呈紧密闭合构象，表面空间位阻阻止抗荧光素-HRP接近3′端荧光素标签；结合BoNT/A后适配体构象开放，暴露荧光素，使抗荧光素-HRP结合。随后在-200 mV下加入TMB/H2O2，HRP催化H2O2还原，TMB作为介体在电极表面发生氧化还原循环，产生安培电流。电流随BoNT/A浓度增加而增大，实现特异性信号放大。
检测灵敏度
LOD: 40 pg/ml (400 fM, 2 SD above noise)；动态范围: 40 pg/ml–100 ng/ml；R^2 = 0.99（溶液识别）；表面识别 LOD: 2,560 pg/ml，R^2 = 0.94；表面结合常数 K = 2.0±0.5×10^-6 (pg/ml)^-1 (3.0±0.8×10^9 M^-1)
效应效果
在100 ng/ml BoNT/A下，溶液识别信号比表面识别高约900 nA，信噪比分别为6.8和1.3；24 h孵育后样品电流为-1986±42 nA，空白为-52±6 nA，SNR达38.2。15 mM KCl给出最高信号和最低背景。对BSA、酪蛋白、IL-8、IL-1b无明显响应，选择性良好。优化LOD 40 pg/ml，与传统免疫分析2–60 pg/ml相当，且24 h完成，短于文中提到的4天记录。表面识别LOD为2560 pg/ml，结合常数较低，说明溶液识别更优。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金薄膜电极阵列（gold thin film, WE/CE/RE），提供导电基底与安培检测界面
- 导电修饰层：聚吡咯（PPy）薄膜，由吡咯电聚合形成，厚度51.5±3.0 nm，传导电子并承载识别层
- 固定/识别支架：链霉亲和素修饰DNA树枝状分子（streptavidin-modified DNA dendrimer, 70–90 nm），共聚合于PPy中，通过生物素-链霉亲和素固定适配体
- 识别元件：76 bp单链DNA适配体（BoNT/A aptamer），5′-生物素、3′-荧光素双标记，特异性结合BoNT/A并发生构象变化
- 信号标记物：抗荧光素-HRP抗体（anti-fluorescein-HRP），结合开放适配体上的荧光素标签，引入HRP催化信号
- 电子供体/底物：TMB/H2O2低活性底物，在-200 mV下经HRP催化发生氧化还原循环，产生安培电流
- 反应缓冲液：1× Tris-HCl含15 mM KCl、140 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2，促进适配体正确折叠与结合
- 抗体孵育/封闭缓冲液：casein/PBS，用于抗荧光素-HRP孵育并降低非特异结合
中文摘要
本文报道了一种基于适配体的电化学传感器，用于检测肉毒神经毒素A类毒素（BoNT/A）。该传感器以金薄膜电极为基底，通过电聚合制备含链霉亲和素-DNA树枝状分子的聚吡咯导电层，利用生物素-链霉亲和素作用固定双标记适配体。适配体5′端标记生物素、3′端标记荧光素，与BoNT/A结合后发生构象变化，由闭合态转为开放态，从而解除空间位阻并允许抗荧光素-HRP抗体结合。随后在-200 mV下以TMB/H2O2为底物进行安培检测，HRP催化产生电流。孵育时间和反应缓冲液中钾离子浓度是影响识别灵敏度的关键参数。在优化条件下，24 h内获得高信噪比，检出限为40 pg/ml（以噪声水平上两个标准偏差为判据）。
英文摘要
We have developed an aptamer-based electrochemical sensor for detection of Botulinum neurotoxin, where steric hindrance is applied to achieve specific signal amplification via conformational change of the aptamer. The incubation time and potassium concentration of the reaction buffer were found to be key parameters affecting the sensitivity of detection of the recognition of Botulinum neurotoxin by the aptamer. Under optimized experimental conditions, a high signal-to-noise ratio was obtained within 24 h with a limit of detection (LOD) of 40 pg/ml by two standard deviation cutoffs above the noise level.