组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
大肠杆菌O157:H7 DNA（Escherichia coli O157:H7 DNA，eaeA基因片段）；样品基质：PBS缓冲液中的单链DNA/不对称PCR产物，目标应用为食品或水样
检测原理
AAO纳米孔膜经APS和戊二醛共价固定特异性ssDNA探针。靶DNA进入孔道后与探针杂交；在Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和PCR buffer存在下，55°C反应使探针作为引物被延伸，形成约120 bp的刚性双链复合物。该复合物占据孔道、改变孔壁表面电荷并影响孔内离子分布，通过体积排阻和电荷效应显著阻塞离子流，使孔电阻Rp增大、膜电容Cm改变。体系以10 mM [Fe(CN)6]3-/4- PBS为氧化还原指示介质，采用CV和EIS读出：靶DNA浓度越高，孔内完整双链复合物越多，峰电流下降和阻抗上升越明显，从而实现无标签检测。
检测灵敏度
LOD: 0.5 nM
效应效果
选择性良好：阴性对照和单碱基错配序列CV曲线无变化，与仅固定探针一致；缺少Taq DNA聚合酶时PE杂交无显著变化。PE杂交使孔电阻Rp由99.20±8.62 Ω增至540.76±25.55 Ω，净增约413 Ω；常规杂交仅增至127.80±5.34 Ω。膜电容Cm由2.76±0.20 nF增至12.03±0.23 nF，表明完整双链复合物显著增强离子阻塞。数据来自至少3次独立检测。文中未直接检测真实食品或水样，但不对称PCR产物检测效果与阳性DNA对照相同。作者认为该无标记、低成本、易集成的AAO膜传感器可发展为自包含生物芯片或手持设备，用于食品、水样现场监测和POCT。
传感器的构成
- 换能器电极：Au工作电极、Pt对电极、Ag/AgCl参比电极，用于CV和EIS测量
- 传感膜基底：AAO纳米孔膜（孔径73±7 nm，厚50 μm，孔密度1×10^9/cm^2），提供离子流通道并固定探针
- 硅烷化修饰层：3-aminopropyltrimethoxysilane（APS），在孔壁引入氨基
- 交联活化层：glutaraldehyde（戊二醛），连接APS氨基与5'-氨基DNA探针
- 中和封闭层：propylamine（丙胺，10^-5 M），中和未反应戊二醛
- 识别元件：5'-aminated ssDNA probe（20-mer，5′-NH2-(CH2)6-CCAAGAGTTGCAGTTCCTGA），特异性识别E. coli O157:H7 eaeA基因
- 信号放大组分：Taq DNA polymerase、dNTPs、Mg2+和PCR buffer，55°C下将探针延伸为120 bp双链
- 检测介质：10 mM [Fe(CN)6]3-/4- PBS（pH 7.0），作为氧化还原指示剂反映离子阻塞
中文摘要
本文报道了一种基于单链DNA（ssDNA）探针功能化铝阳极氧化（AAO）纳米孔膜的电化学生物传感器，用于检测大肠杆菌O157:H7 DNA。作者提出一种新颖的动态聚合酶延伸（PE）DNA杂交方法：在Taq DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）存在下，于控制温度中进行杂交，使固定探针被延伸为与靶DNA等长的双链复合物，从而显著增强其对纳米孔内离子流的阻塞能力。研究采用循环伏安法和阻抗谱考察了膜制备及杂交过程中离子电导的变化。该方法具有较低的DNA检测限（数百皮摩尔量级），可实现快速、无标记、易用的细菌DNA检测，并有望集成到自包含生物芯片中，用于多种单链DNA分析。
英文摘要
A novel biosensor based on single-stranded DNA (ssDNA) probe functionalized aluminum anodized oxide (AAO) nanopore membranes was demonstrated for Escherichia coli O157:H7 DNA detection. An original and dynamic polymerase-extending (PE) DNA hybridization procedure is proposed, where hybridization happens in the existence of Taq DNA polymerase and dNTPs under controlled reaction temperature. The probe strand would be extended as long as the target DNA strand, then the capability to block the ionic flow in the pores has been prominently enhanced by the double strand complex. We have investigated the variation of ionic conductivity during the fabrication of the film and the hybridization using cyclic voltammetry and impedance spectroscopy. The present approach provides low detection limit for DNA (a few hundreds of pmol), rapid label-free and easy-to-use bacteria detection, which holds the potential for future use in various ss-DNA analyses by integrated into a self-contained biochip.