组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）活性、磷酸化Kemptide（phosphorylated Kemptide）、抑制剂ellagic acid（ellagic acid）的IC50；样品基质：激酶反应缓冲液（kinase buffer，含ATP、BSA、β-巯基乙醇）
检测原理
Kemptide经MAA/EDC-NHS固定于金电极，PKA在ATP存在下催化其丝氨酸残基磷酸化，磷酸基团作为识别基团与TiO2纳米颗粒表面特异性结合，实现磷酸化产物的富集与信号转换。TiO2在365 nm UV激发下产生光生电子，将AgNO3中的Ag+还原为Ag纳米颗粒并沉积于TiO2表面，形成信号放大层。随后DPV在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.2）中氧化Ag产生阳极电流，电流大小与磷酸化Kemptide量、PKA活性成正比；加入抑制剂时磷酸化减少，Ag沉积减少，电流降低。硫代硫酸钠清洗去除过量Ag+以降低背景。
检测灵敏度
LOD: 0.2 U mL-1；线性范围: 0–1 U mL-1
效应效果
传感器对PKA活性检测具有良好选择性，仅用MAA修饰而无Kemptide的电极未出现显著DPV响应，说明信号来自磷酸化底物而非非特异吸附。在5 U mL-1 PKA饱和响应下RSD为8.2%（n=5），表明重现性可接受。作者称其灵敏度优于或可与此前报道方法相当。利用ellagic acid作为模型抑制剂，DPV信号随抑制剂浓度增加而下降，测得IC50约5.5 mM，证明可用于定量表征激酶抑制并筛选潜在抑制剂。方法无需放射性或荧光标记，适合高通量激酶活性与抑制剂筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），承载肽固定并提供DPV电化学信号读出
- 底物固定层：巯基乙酸（MAA）与EDC-NHS活化金表面，用于共价固定Kemptide肽
- 识别底物：Kemptide肽，作为PKA磷酸化底物，磷酸化后提供磷酸基团
- 识别基团：磷酸基团（phosphate group），由PKA催化生成，与TiO2表面特异性结合
- 纳米材料修饰层：TiO2纳米颗粒（TiO2 NPs），结合磷酸基团并作为光催化信号转换介质
- 信号放大层：AgNO3在UV下经TiO2光催化还原沉积为Ag纳米颗粒（Ag NPs），作为DPV氧化靶标
- 清洗/抗干扰层：2,5-二羟基苯甲酸（DHB）洗脱液去除非特异结合酸性肽；硫代硫酸钠固定液将过量Ag+转化为Ag(S2O3)3^5-
- 反应/读出体系：激酶缓冲液（kinase buffer）含ATP、BSA、β-巯基乙醇；DPV在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.2）中氧化Ag
中文摘要
本文报道一种基于TiO2辅助银纳米颗粒增强的电化学生物传感器，用于蛋白激酶活性及其抑制的灵敏检测。以蛋白激酶A（PKA）为模型酶，Kemptide为底物肽，通过巯基乙酸（MAA）和EDC-NHS化学将其固定于金电极表面。PKA在ATP存在下催化Kemptide磷酸化，生成的磷酸基团与TiO2纳米颗粒特异性结合，实现磷酸化产物的富集与信号转换。随后在AgNO3溶液中经365 nm紫外光催化，TiO2表面沉积Ag纳米颗粒，作为电化学检测靶标。差分脉冲伏安法（DPV）氧化Ag产生电流，信号与磷酸化肽量及激酶活性成正比。该传感器PKA检出限为0.2 U mL-1，线性范围为0–1 U mL-1，并可测定抑制剂ellagic acid的IC50约5.5 mM，具有高通量筛选激酶抑制剂的潜力。
英文摘要
An electrochemical biosensor has been developed for sensitive determination of protein kinase activity and inhibition, taking advantage of specific binding of the phosphate groups with TiO2 nanoparticles, on which silver nanoparticles are photo-catalytically deposited to achieve signal enhancement.