组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）活性（通过 L-谷氨酸间接检测）；样品基质：PBS 缓冲液（含 L-丙氨酸和 α-酮戊二酸）及模拟生理干扰液，未报告实际血清/血浆样品
检测原理
ALT 在溶液中将 L-丙氨酸和 α-酮戊二酸催化转化为丙酮酸和 L-谷氨酸，ALT 活性越高，L-谷氨酸生成速率越大。L-谷氨酸扩散至 GlutOx 修饰电极，被 GlutOx(FAD) 氧化为 α-酮戊二酸，同时 FAD 还原为 FADH2。介导路径中，FADH2 将电子转移给 FCA，FCA 在 Pt 电极 0.4 V 处再氧化，产生与 ALT 活性成正比的安培电流；非介导路径中，FADH2 还原 O2 生成 H2O2，H2O2 在 0.7 V 处直接氧化产生电流。失活酶电极用于扣除抗坏血酸和尿酸背景。该体系无额外化学放大，主要依靠酶催化转化和介导电子转移提高灵敏度。
检测灵敏度
介导安培法（308 K，Eapp=0.4 V vs. Ag/AgCl）：LOD: 3.29 U L−1；线性范围: 10–1000 U L−1；灵敏度: 0.845 nA U−1 L；R^2 = 0.993；t90 = 180 s。
效应效果
该传感器 6 个月稳定性测试完成 >200 次测量后保留 79% 活性，40 天保留约 88%；电极内 RSD 6.9%（n=4），电极间 RSD 4.5%（n=5，20 U L−1 ALT）。利用失活谷氨酸氧化酶电极背景扣除，可在生理浓度抗坏血酸和尿酸存在下定量，干扰存在时谷氨酸灵敏度平均 0.505 nA μM−1（297 K）和 1.644 nA μM−1（308 K），与无干扰标准接近。相比 Song 等（<4 个月、0.136 nA U−1 L、1.3–250 U L−1）和 Chang 等（<6 个月、0.595 nA U−1 L、8–250 U L−1），本工作稳定性、灵敏度与线性范围更优。作者认为可拓展为肝酶多分析物检测，后续用于血清/血浆。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：铂电极（Pt，0.055 cm2），机械抛光后作为工作电极，提供电子转移动力
- 交联/固定层：谷氨酸氧化酶（GlutOx，0.16 U/电极）与牛血清白蛋白（BSA，2.0% w/v）、戊二醛（1.0% v/v）交联，固定酶并维持活性
- 成膜/稳定层：Nafion（0.2% w/v 全氟离子交换树脂），形成稳定酶膜，提高电极操作稳定性
- 反应底物：L-丙氨酸（L-alanine，100 mM）和 α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，10 mM），作为 ALT 催化底物，将 ALT 活性转化为 L-谷氨酸生成
- 电子介体：羧基二茂铁（ferrocene carboxylic acid, FCA，0.2 mM），介导 GlutOx(FADH2) 电子转移至电极，降低工作电位
- 对照/干扰扣除电极：失活谷氨酸氧化酶电极（100 °C 10 min 变性），用于背景扣除抗坏血酸和尿酸干扰
- 电化学测量组件：Ag/AgCl 参比电极、Pt 丝对电极和 CHI 600/CHI 1060 电位计，完成循环伏安与安培测量
- 缓冲介质：PBS（pH 7.4），维持酶活性、离子强度和反应环境
中文摘要
本文报道了一种用于检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的稳定、选择性电化学生物传感器。该传感器以谷氨酸氧化酶（GlutOx）修饰的铂电极为识别与换能界面，在 ALT 共底物 L-丙氨酸和 α-酮戊二酸存在下，通过检测 ALT 催化反应生成的 L-谷氨酸实现间接测定 ALT 活性。测量可采用过氧化氢直接氧化电流，或采用羧基二茂铁（FCA）介导的再氧化电流。酶电极在 6 个月稳定性测试中完成超过 200 次测量后仍保留 79% 初始活性。利用失活谷氨酸氧化酶电极进行背景扣除，可消除抗坏血酸和尿酸等生理电活性干扰物的信号。在 308 K、Eapp=0.4 V vs. Ag/AgCl 条件下，介导安培法灵敏度为 0.845 nA U−1 L，t90=180 s，线性范围为 10–1000 U L−1，检出限为 3.29 U L−1。
英文摘要
An electrochemical method to determine alanine aminotransferase (ALT) activity over its normal and elevated physiological range was developed based upon detection of L-glutamate at a glutamate oxidase-modified platinum electrode. Measurements were carried out in the presence of ALT co-substrates L-alanine and alpha-ketoglutarate and current response from either the oxidation of hydrogen peroxide or the re-oxidation of the mediator ferrocene carboxylic acid was employed. The enzyme electrode was tested over a 6-month period and found to retain 79% of its original activity towards ALT detection with >200 measurements performed over this time. Signals associated with interfering electroactive species (ascorbic acid and uric acid) were eliminated using background subtraction at a denatured glutamate oxidase enzyme electrode. The sensitivity of the device was found to be 0.845 nA U(-1) L ALT with t(90)=180 s, linear range 10-1000 U L(-1) and LOD of 3.29 U L(-1) using amperometry at E(app)=0.4 V vs. Ag/AgCl at 308 K (35 degrees C).