组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
乙醇（ethanol, EtOH）；样品基质：葡萄酒（红葡萄酒、白葡萄酒）及磷酸盐缓冲盐水加标
检测原理
乙醇进入传感器后，被固定在PNR膜上的AlcOx催化氧化，酶辅因子FAD被还原为FADH2。PNR作为氧化还原介质接受FADH2的电子，形成PNR还原态；随后PNR还原态在碳膜电极表面被氧化，产生阳极电流。该电流大小与乙醇浓度相关，因此通过恒电位计时电流即可定量乙醇。工作电位选择-0.300 V vs SCE，接近FAD/FADH2形式电位，有利于电子传递并降低干扰。在无氧条件下，PNR替代O2作为电子受体，避免依赖H2O2检测，减少竞争反应并提高响应。
检测灵敏度
LOD: 29.7 ± 1.5 μM；线性范围: 最高0.7 ± 0.1 mM；灵敏度: 171.8 ± 14.8 nA mM−1；R^2 = 0.999
效应效果
传感器重现性良好：三个电极的线性范围RSD为4.3%，LOD RSD为5.2%，灵敏度RSD为8.6%；表观Michaelis–Menten常数Kapp为1.96 ± 0.12 mM（RSD 5.7%）。对甲醇、乙醇和1-丙醇的灵敏度分别为144、139和53 nA mM−1，显示对乙醇有良好响应且随醇链增长响应降低。葡萄酒常见干扰物在2:1摩尔比下响应基本保持，抗坏血酸和酒石酸仅使乙醇响应降低3.5%和3.3%。稳定性方面，4℃储存6周后灵敏度仅下降约12%；每周使用2–3次，3周后保留57.6%初始灵敏度。实际葡萄酒分析中，红葡萄酒1、红葡萄酒2和白葡萄酒测得乙醇分别为13.0 ± 0.2、13.2 ± 0.1和12.3 ± 0.2% (v/v)，与生产商标示值接近，表明可用于食品与临床乙醇检测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：碳膜电极（carbon film electrode，由碳膜电阻器制成，几何面积约0.20 cm²），作为工作电极与电子传导基底
- 氧化还原介质层：聚中性红（poly(neutral red), PNR），由中性红（neutral red, NR）电聚合形成，介导酶辅因子FAD/FADH2与电极间电子传递
- 识别/固定层：酒精氧化酶（alcohol oxidase, AlcOx，来自Hansenula polymorpha），催化乙醇氧化；戊二醛（glutaraldehyde, GA）交联固定，牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）作为载体蛋白
- 缓冲介质：0.1 M磷酸盐缓冲盐水（NaPBS，pH 7.5），提供离子环境与酶活性条件
- 电化学电极：饱和甘汞电极（SCE）作参比电极，铂箔作对电极，构成三电极体系
- 信号读出：恒电位计时电流（chronoamperometry），在-0.300 V vs SCE下记录阳极电流
中文摘要
本文报道并优化了一种用于乙醇监测的新型安培生物传感器。该传感器以碳膜电极为工作电极，在其表面电聚合聚中性红（poly(neutral red), PNR）作为氧化还原介质，并将来自 Hansenula polymorpha 的酒精氧化酶（alcohol oxidase, AlcOx）作为生物识别元件，通过戊二醛（glutaraldehyde, GA）交联并在牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）存在下固定。系统对影响性能的关键变量进行了优化，计时电流测量在 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（NaPBS，pH 7.5）中、相对于饱和甘汞电极（SCE）-0.300 V 下进行。优化后的传感器表现出良好灵敏度 171.8 ± 14.8 nA mM−1，对应检出限（信噪比=3）为 29.7 ± 1.5 μM。稳定性研究显示传感器生物分析性能保持良好，每周使用 2–3 次、3 周后仍保留 57.6% 的初始灵敏度。葡萄酒中常见化合物未造成显著干扰，该传感器被用于葡萄牙红葡萄酒和白葡萄酒中乙醇的测定。
英文摘要
A new amperometric biosensor for ethanol monitoring has been developed and optimised. The biosensor uses poly(neutral red) (PNR), as redox mediator, which is electropolymerised on carbon film electrodes and alcohol oxidase (AlcOx) from Hansenula polymorpha as recognition element, immobilised by cross-linking with glutaraldehyde (GA) in the presence of bovine serum albumin (BSA) as carrier protein. Optimisation of variables affecting the system was performed and, for chronoamperometric measurements, a potential of -0.300 V versus saturated calomel electrode was chosen in 0.1M sodium phosphate buffer saline at pH 7.5. The optimised biosensor showed a good sensitivity of 171.8+/-14.8nAmM(-1) and the corresponding detection limit (signal-to-noise-ratio=3) of 29.7+/-1.5 microM. Stability studies showed a good preservation of the bioanalytical properties of the sensor, 57.6% of its initial sensitivity remaining after 3 weeks (the sensor was used two to three times per week). No significant interferences were found from compounds usually present in wine. The biosensor was used for the determination of ethanol in Portuguese red and white wines.