组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
环磷酸鸟苷（cGMP）、环磷酸腺苷（cAMP）、钙离子（Ca2+）；样品基质：活细胞胞内（PC12细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、大鼠海马神经元）
检测原理
Cygnus由mTagBFP、人源PDE5A1 cGMP结合域和暗YFP受体sREACh串联组成。mTagBFP为蓝色荧光供体，sREACh为非辐射FRET受体。无cGMP时，供体与受体间FRET效率较低，mTagBFP在405 nm激发下于440–480 nm发射较强荧光。cGMP结合PDE5A1结合域后，融合蛋白发生构象变化，使mTagBFP与sREACh距离或取向改变，FRET效率升高，mTagBFP荧光能量被sREACh非辐射耗散，导致440–480 nm荧光强度下降。因此单波长荧光信号随胞内cGMP浓度升高而降低。该传感器与Epac1-camps（CFP/YFP FRET cAMP传感器）和Fura Red（Ca2+探针）光谱兼容，通过不同激发和发射通道分别读出，实现三参数成像。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；原文另报告cGMP对cAMP选择性约400倍。
效应效果
Cygnus在体外和活细胞中对cGMP选择性高，cGMP/cAMP选择性约400倍；腺苷/IBMX升高cAMP时Cygnus无响应。SNAP刺激PC12（n=7）、HEK293T（n=6）和海马神经元（n=6）均产生可逆荧光下降。响应幅度小于cGES-DE5的YFP/CFP比值，但接近其CFP变化。重复激发下信号无显著漂移，无光激活/光转换，光稳定性足够。mTagBFP pKa约3.0，sREACh pKa约4.5，pH稳定性高。与Epac1-camps、Fura Red联合时未见明显光谱串扰，可分别监测cAMP、cGMP、Ca2+。作者认为适用于多参数荧光成像与复杂信号网络研究。
传感器的构成
- 供体荧光蛋白：mTagBFP，蓝色荧光供体，405 nm激发、440–480 nm发射，提供单波长荧光信号。
- 识别元件：人源PDE5A1 cGMP结合域（氨基酸154–308），特异性结合cGMP并介导构象变化。
- 受体荧光蛋白：sREACh，暗YFP突变体（含Q69M，基于Citrine），作为非辐射FRET受体，cGMP结合后增强能量转移并淬灭mTagBFP。
- 表达载体：pcDNA3.1(+)真核表达载体，含Kozak序列，用于HEK293T、PC12、HeLa和神经元转染表达。
- 多参数成像伴侣：Epac1-camps（CFP/YFP FRET cAMP传感器）和Fura Red（红色Ca2+探针），与Cygnus光谱兼容，用于三参数成像。
中文摘要
环磷酸鸟苷（cGMP）通过与环磷酸腺苷（cAMP）和钙离子（Ca2+）等信号分子协同作用，调节多种生理过程。基于荧光蛋白荧光共振能量转移（FRET）的cGMP遗传编码传感器已被开发，但现有传感器光谱重叠严重，难以在单细胞中联合使用。单波长指示剂是避免该问题的有效替代方案，但基于单一荧光蛋白的生物传感器颜色变体有限。本研究利用暗FRET受体，将FRET型传感器转化为单波长指示剂，构建了蓝色荧光cGMP生物传感器。该传感器与采用青色/黄色荧光蛋白（CFP/YFP）的FRET型cAMP传感器光谱兼容。作者将其与cAMP传感器共转染，并向细胞装载红色Ca2+荧光探针，实现了cAMP、cGMP和Ca2+的三参数荧光成像，证实该组合可在单细胞中分别监测这些第二信使的动态变化。该蓝色荧光传感器及基于暗FRET受体的策略有助于多参数荧光成像，用于解析复杂信号转导网络。
英文摘要
Cyclic GMP (cGMP) regulates many physiological processes by cooperating with the other signaling molecules such as cyclic AMP (cAMP) and Ca(2+). Genetically encoded sensors for cGMP have been developed based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) between fluorescent proteins. However, to analyze the dynamic relationship among these second messengers, combined use of existing sensors in a single cell is inadequate because of the significant spectral overlaps. A single wavelength indicator is an effective alternative to avoid this problem, but color variants of a single fluorescent protein-based biosensor are limited. In this study, to construct a new color fluorescent sensor, we converted the FRET-based sensor into a single wavelength indicator using a dark FRET acceptor. We developed a blue fluorescent cGMP biosensor, which is spectrally compatible with a FRET-based cAMP sensor using cyan and yellow fluorescent proteins (CFP/YFP). We cotransfected them and loaded a red fluorescent probe for Ca(2+) into cells, and accomplished triple-parameter fluorescence imaging of these cyclic nucleotides and Ca(2+), confirming the applicability of this combination to individually monitor their dynamics in a single cell. This blue fluorescent sensor and the approach using this FRET pair would be useful for multiparameter fluorescence imaging to understand complex signal transduction networks.