组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
生物素化碳酸酐酶II（bCAII，biotinylated CAII）作为靶标配体；未指定具体小分子分析物（样品基质：10 mM Hepes、150 mM NaCl、0.005% P20、0.1 mg/mL BSA 缓冲液）
检测原理
该传感器基于表面等离子共振（SPR）实时监测界面质量/折射率变化。Biacore CAP芯片表面先形成寡核苷酸层，再与寡核苷酸-链霉亲和素杂交，构成可再生链霉亲和素捕获层。目标蛋白CAII经胺基或羧基生物素化后，以生物素-链霉亲和素高亲和相互作用固定于表面；未生物素化蛋白随缓冲液流出。分析物（小分子/底物）与表面CAII结合后，界面质量增加，SPR共振角改变，Biacore以共振单位（RU）记录响应。过度生物素化使单个蛋白携带多个生物素，可同时占据多个链霉亲和素位点并交联，降低有效捕获容量；游离生物素则竞争链霉亲和素位点，使捕获下降。CAP芯片可通过再生试剂去除分析物/靶标/链霉亲和素复合物，实现重复装载与条件筛选。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
CAP芯片重复装载、捕获和再生稳定：同一流动池内多次捕获水平变异约3%，四个流动池间首末差异约13%，平均捕获约2000 RU，归一化后可补偿。游离生物素竞争抑制明显，约0.25:1游离生物素/靶标比时捕获被抑制约50%。脱盐比较中，V系列膜无法回收蛋白；四种透析法需约16 h达最大捕获；Pierce透析盒更高效；双次离心柱最快，但需BSA预处理或样品加BSA防止蛋白损失。羧基生物素化约3 h达最大，捕获密度可与胺基法相当，约2000 RU。100 mM Tris仅抑制约40%，甘油和ATP影响小，甘氨酸显著抑制。作者认为该方法简单、可一天内优化，适合高亲和相互作用和生物素化试剂系统。
传感器的构成
- 基底/换能器：Biacore CAP 芯片（SPR 换能基底），提供可再生寡核苷酸表面并检测共振信号
- 修饰层：oligo surface（寡核苷酸表面），与寡核苷酸-链霉亲和素杂交形成可再生捕获层
- 捕获/识别元件：oligo-linked streptavidin（寡核苷酸-链霉亲和素 CAPture reagent），特异性结合生物素化靶标
- 靶标配体：biotinylated CAII（bCAII，生物素化碳酸酐酶II），通过生物素-链霉亲和素结合固定于表面
- 生物素化试剂：EZ-Link sulfo-NHS-LC-LC-biotin（胺基）或 EDC + EZ-Link pentylamine-biotin（羧基），制备 bCAII
- 运行/封闭缓冲液：10 mM Hepes、150 mM NaCl、0.005% P20、0.1 mg/mL BSA（pH 7.4），维持活性并减少非特异吸附
- 再生/封闭：regeneration reagents（3:1 8-M guanidine HCl/1 M NaOH）及可选 D-biotin，去除复合物或封闭剩余链霉亲和素位点
中文摘要
本研究利用Biacore新型可再生链霉亲和素捕获（CAP）传感器芯片，系统考察目标配体生物素化的最小化条件。作者比较了常用胺基生物素化与较少使用的羧基生物素化策略，评估了生物素化试剂与蛋白摩尔比、反应时间、游离生物素去除程度以及不同脱盐方法对链霉亲和素表面捕获效率的影响。结果表明，过度生物素化会使一个配体分子占据多个链霉亲和素位点并发生交联，从而降低表面捕获容量；在约1:1摩尔比下胺基生物素化可获得较高捕获水平，而低于1:1时可通过延长注射时间获得类似密度。羧基生物素化在EDC和戊胺-生物素存在下约3 h达到最大效率，捕获密度可与胺基法相当。游离生物素会竞争链霉亲和素位点，约0.25:1游离生物素/靶标比时捕获被抑制约50%。脱盐比较显示，V系列膜效果差，多种透析法需约16 h，Pierce透析盒更高效，双次离心柱最快但需BSA保护蛋白。Tris、甘油和ATP对生物素化影响有限，甘氨酸则显著抑制。该工作为生物传感器中目标配体的最小化生物素化提供了实用指南。
英文摘要
Using Biacore's new regenerateable streptavidin capture (CAP) sensor chips, we investigated a number of biotinylation conditions for target ligands. We explored standard amine as well as the less commonly used carboxyl biotinylation methods. We illustrate the time scales required for efficient biotinylation as well as the hazards of overbiotinylation. We evaluated a range of desalting methods, including spin columns, dialysis membranes, and filters. Finally, we tested the effects of common buffer components, such as Tris and glycerol, on the biotinylation process. Together, our results serve as a general guide of the steps to consider when minimally biotinylating a target ligand.