组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
β2 肾上腺素能受体（β2AR/ADRB2）内化程度；样品基质：活细胞（NIH 3T3 小鼠成纤维细胞、U937 人淋巴母细胞）
检测原理
该传感器以活细胞表达的 b2AR-FAP 融合蛋白为识别与换能单元。未刺激时，膜不通透荧光素只能进入细胞外空间并结合细胞表面 FAP，使细胞膜呈现强荧光。加入激动剂异丙肾上腺素后，b2AR 被激活并发生磷酸化、arrestin 招募和内吞，FAP 域随受体从细胞表面转入胞内囊泡。由于荧光素不能进入细胞，表面 FAP 减少导致表面荧光下降，即表面荧光耗竭法；若荧光素与激动剂同时加入，内化 FAP 仍结合荧光素，随后用胰蛋白酶去除表面 FAP，则胞内荧光上升，即胞内荧光积累法。荧光强度或位置变化直接反映受体内化程度，无需酶催化放大。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该传感器在 NIH 3T3 和 U937 细胞中均给出稳健的受体内化读出。表面荧光耗竭法中，激动剂处理 40–45 min 后平均荧光较未刺激对照下降约 800 强度单位；胞内荧光积累法经胰蛋白酶去除表面 FAP 后，平均荧光较对照上升约 850 强度单位。时间序列显示信号数分钟开始下降，约 45 min 后稳定在初始值的约三分之一。异丙肾上腺素剂量反应 EC50 约 65 nM，普萘洛尔 IC50 约 3.5 nM。方法为均相、无洗涤和分离步骤，适合自动化高内容筛选、微孔板荧光和流式细胞术。作者主张其可推广至其他 GPCR 和细胞表面蛋白，用于激动剂/拮抗剂筛选、孤儿受体去孤儿、靶点确认和交叉反应评估。
传感器的构成
- 细胞基底：NIH 3T3 小鼠成纤维细胞或 U937 人淋巴母细胞，作为表达和承载 FAP-b2AR 的活细胞平台。
- 识别元件：人 β2 肾上腺素能受体（b2AR/ADRB2），位于细胞膜，识别激动剂并发生内化。
- 荧光激活蛋白（FAP）：单链抗体 HL1.0.1-T01 或 HL4-MG，融合于 b2AR 胞外 N 端，结合荧光素后激活荧光。
- 荧光素标记物：膜不通透 T01-2p（噻唑橙衍生物）或 MG-11p（孔雀绿衍生物），仅标记细胞表面 FAP 并产生荧光。
- 激动剂刺激物：异丙肾上腺素（isoproterenol），结合 b2AR 触发受体磷酸化、arrestin 招募和内吞。
- 拮抗剂对照：普萘洛尔（propranolol），竞争性抑制激动剂诱导的受体内化。
- 表面去除试剂：胰蛋白酶（trypsin），在内部荧光积累法中去除表面 FAP，保留内化荧光。
- 读出系统：Olympus IX50 旋转盘共聚焦荧光显微镜或 BD FACS Vantage SE 流式细胞仪，检测荧光强度与亚细胞位置。
中文摘要
配体依赖性受体内化是 G 蛋白偶联受体（GPCR）信号脱敏的重要机制。传统下游报告基因或第二信使检测易受脱靶效应影响，而 GFP 融合蛋白虽可直接标记受体，但单细胞荧光强度不随响应变化，不适合基于信号强度的高通量筛选。本文报道一种基于荧光激活蛋白（FAP）技术的活细胞生物传感器，用于检测人 β2 肾上腺素能受体（b2AR）的内化。作者将 b2AR 胞外 N 端融合 FAP 域的重组基因转导至 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞和 U937 人淋巴母细胞。加入膜不通透荧光素后，细胞表面 FAP 被选择性标记并产生强荧光；激动剂诱导受体从细胞表面内吞至胞内囊泡时，荧光位置与强度发生可定量变化。通过荧光显微镜或流式细胞术可在无洗涤、无分离的均相格式中观察和定量内化。该方法可推广至其他受体和细胞表面蛋白，并适配多种荧光高通量筛选平台。
英文摘要
Ligand-dependent receptor internalization is a feature of numerous signaling systems. In this article, the authors describe a new kind of live-cell biosensor of receptor internalization that takes advantage of fluorogen-activating protein (FAP) technology. Recombinant genes that express the human beta2 adrenergic receptor (beta2AR) with FAP domains at their extracellular N-termini were transduced into mammalian cells. Exposure of the cells to membrane-impermeant fluorogens led to a strong fluorescent signal from the cell surface. Agonist-dependent translocation of the receptor from the surface to the cell interior was readily observed and quantified by fluorescence microscopy or flow cytometry in a homogeneous format without wash or separation steps. The approach described here is generalizable to other receptors and cell surface proteins and is adaptable to a variety of fluorescence-based high-throughput screening platforms.