组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
双链寡核苷酸（dsDNA，HCV genotype 3a core/E1区，ds-HCV3a）；样品基质：磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）及Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，含20 mM NaCl）
检测原理
该传感器利用PNA探针与目标双链DNA之间的三链杂交实现识别。PNA探针通过巯基/半胱氨酸锚定在金电极表面，MCH封闭降低非特异吸附。目标dsDNA无需变性，PNA以Watson–Crick和Hoogsteen氢键与dsDNA中的嘌呤链结合，形成PNA–dsDNA三螺旋。三链结构为亚甲基蓝（MB）提供嵌入位点，使DPV还原峰电流增大；非互补dsDNA不能形成稳定三链，MB信号基本不变。信号以杂交前后MB还原峰差分ΔI表示，随目标浓度升高而增大，在10–100 pM呈线性。方法未使用HCR、RCA或酶催化放大，主要依靠PNA三链识别和MB嵌入指示。
检测灵敏度
LOD: 1.8×10−12 M；线性范围: 10–100 pM；回归方程: y ΔI = 30.6 + 0.79 X pM；R^2 = 0.999
效应效果
选择性方面，1 nM非互补ds-UGT、ds-HCV1a及其混合液均不引起MB还原信号显著增加；互补ds-HCV3a单独存在与两种非互补序列混合存在时的MB信号几乎相同，说明传感器可在全匹配dsDNA与非匹配dsDNA混合液中识别目标。重现性方面，100 pM ds-HCV3a在三个独立PNA修饰电极上的RSD为3.1%。优化实验显示，预加热电极滴杂交较普通滴杂交使MB信号提高70%；探针浓度5 µM时信号最佳，高于7 µM因空间/静电阻碍导致三链形成减少；杂交20 h达到平台，4–5 h可获得最大信号的65–70%。作者认为该策略无需变性，可简化检测流程并降低污染风险，可作为HCV3a dsDNA检测的基础平台。
传感器的构成
- 基底/换能器：多晶金盘电极（AuE，polycrystalline gold working electrode，3 mm直径），提供电子转导与PNA自组装表面。
- 识别元件：14-mer肽核酸探针（PNA probe pHCV3a，Cys-O-O-CACACATATCACCC），通过巯基/半胱氨酸锚定到金表面，与HCV3a dsDNA形成三链。
- 封闭/修饰层：6-巯基-1-己醇（MCH，6-mercapto-1-hexanol，1 mM水溶液），填充PNA-SAM空隙并降低非特异吸附。
- 信号标记物：亚甲基蓝（MB，methylene blue，20 µM），嵌入PNA-dsDNA三链结构，其DPV还原峰随杂交增强。
- 电解液/缓冲体系：20 mM Tris-HCl（pH 7.0）含20 mM NaCl，用于MB积累与DPV测量；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）用于目标杂交与LOD测定。
- 参比/辅助电极：饱和甘汞电极（SCE）与铂丝辅助电极，构成三电极电化学测量体系。
中文摘要
本文报道了一种基于肽核酸（PNA）探针和双链DNA杂交的电化学生物传感器，用于直接检测并区分对应丙型肝炎病毒（HCV）3a基因型core/E1区的双链寡核苷酸（dsDNA），无需对目标DNA进行变性。传感器以多晶金盘电极为基底，将14-mer PNA探针pHCV3a自组装于金表面，并用6-巯基-1-己醇（MCH）封闭。当目标dsDNA与PNA探针结合形成PNA–dsDNA三链结构时，亚甲基蓝（MB）嵌入量增加，差分脉冲伏安法（DPV）还原峰电流显著增强，从而实现检测与区分。非互补双链寡核苷酸不产生明显信号。在pH 7.0磷酸盐缓冲液中，检出限为1.8×10−12 M；100 pM目标dsDNA在三个独立探针修饰电极上的相对标准偏差为3.1%，表明方法重现性良好。
英文摘要
Development of an electrochemical DNA biosensor for the direct detection and discrimination of double-stranded oligonucleotide (dsDNA) corresponding to hepatitis C virus genotype 3a, without its denaturation, using a gold electrode is described. The electrochemical DNA sensor relies on the modification of the gold electrode with 6-mercapto-1-hexanol and a self-assembled monolayer of 14-mer peptide nucleic acid probe, related to the hepatitis C virus genotype 3a core/E1 region. The increase of differential pulse voltammetric responses of methylene blue, upon hybridization of the self-assembled probe with the target ds-DNA to form a triplex is the principle behind the detection and discrimination. Some hybridization experiments with non-complementary oligonucleotides were carried out to assess whether the developed DNA sensor responds selectively to the ds-DNA target. Diagnostic performance of the biosensor is described and the detection limit was found to be 1.8 x 10(-12) M in phosphate buffer solution, pH 7.0. The relative standard deviation of measurements of 100 pM of target ds-DNA performed with three independent probe-modified electrodes was 3.1%, indicating a remarkable reproducibility of the detection method.