组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
乙酰胆碱结合蛋白（AChBP）配体/小分子化合物（他克林 tacrine、尼古丁 nicotine、乙酰胆碱 acetylcholine、epibatidine、VUF 10674）；样品基质为DMSO储备液稀释后的运行缓冲液（磷酸盐或PBS-Tris含P20）
检测原理
SPR传感器表面通过EDC/NHS共价固定或Ni-NTA可逆捕获AChBP。初筛中，小分子测试化合物直接结合AChBP，引起界面质量/折射率变化，产生共振单位（RU）响应；结合量随化合物浓度和亲和力增加。复筛采用顺序竞争：先注入测试化合物占据AChBP结合位点，随后立即注入高分子量报告配体α-金枪鱼毒素（BgTx）。BgTx仅结合剩余自由位点，其结合斜率（RBS）随测试化合物占据量增加而降低。由于BgTx分子量约8 kDa，远大于小分子，结合产生更大SPR质量响应，实现信号放大；通过比较RBS与缓冲液对照，可区分结合物与非结合物，并降低假阳性。
检测灵敏度
EC50: 55 nM (r2 = 0.96)；EC50: 7.3 μM (r2 = 0.98)；EC50: 9.4 μM (r2 = 0.99)
效应效果
初筛固定约3000 RU AChBP，表面至少稳定4天；复筛捕获约1000 RU时基线漂移0–15 RU/min。复筛信噪比为36，直接法为13，z0因子0.96，两种方法重现性相当。顺序竞争法对BgTx结合口袋具有选择性，非特异结合物不被检出，ERα-LBD对照无BgTx结合，可有效识别假阳性。他克林在初筛和复筛中均被检出，放射配体实验pKi为4.3，EC50为9.4 μM，低于乙酰胆碱亲和力。作者认为该方法适合低亲和力配体发现与nAChR先导化合物验证。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5或NTA SPR传感芯片，提供表面等离子共振信号读出
- 表面修饰层：CM5芯片经EDC/NHS氨基偶联固定AChBP；NTA芯片负载Ni(II)螯合His标签
- 识别元件：六组氨酸标签Ls-AChBP或Ac-AChBP，作为nAChR配体结合域模型蛋白
- 信号标记物：α-金枪鱼毒素BgTx，高分子量报告配体，结合剩余AChBP位点产生SPR响应
- 再生/清洗：EDTA去除NTA捕获蛋白；50% DMSO与70%乙醇冲洗去除残留化合物
- 运行缓冲液：PBS-Tris或磷酸盐缓冲液含0.005% P20表面活性剂，维持结合环境并降低非特异吸附
中文摘要
表面等离子共振（SPR）生物传感器在药物发现中日益重要。本文提出一种用于乙酰胆碱结合蛋白（AChBP）配体初筛和复筛的SPR生物传感器方法。初筛采用共价固定靶蛋白的直接结合检测；复筛采用顺序竞争检测：先将捕获的蛋白暴露于未知测试化合物，随后立即暴露于高分子量报告配体。利用报告配体探测传感器表面剩余自由结合位点，可显著增强信号，并验证直接结合初筛结果，有效识别假阳性。以AChBP作为神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的可溶性模型蛋白。复筛通量低于初筛，但信噪比约为直接检测的2倍，z0因子为0.96。结合两种方法，作者鉴定出他克林（tacrine）为AChBP配体。
英文摘要
Surface plasmon resonance (SPR) biosensors recently gained an important place in drug discovery. Here we present a primary and secondary SPR biosensor screening methodology. The primary screening method is based on a direct binding assay with covalent immobilized drug target proteins. For the secondary screening method, a sequential competition assay has been developed where the captured protein is first exposed to an unknown test compound, followed directly by an exposure to a high-molecular-weight reporter ligand. Using the high-molecular-weight reporter ligand to probe the remaining free binding site on the sensor, a significant signal enhancement is obtained. Furthermore, this assay format allows the validation of the primary direct binding assay format, efficiently revealing false positive data. As a model system, acetylcholine binding protein (AChBP), which is a soluble model protein for neuronal nicotinic acetylcholine receptors, has been used. The secondary assay is lower in throughput than the primary assay; however, the signal-to-noise ratio is two times higher compared with the direct assay, and it has a z' factor of 0.96. Using both assays, we identified the compound tacrine as a ligand for AChBP.