组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
致病性大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）的eaeA基因/细菌基因组DNA；样品基质：纯化细菌基因组DNA（文中面向食品样品）
检测原理
以致病大肠杆菌基因组为模板，用5′-生物素和3′-地高辛（DIG）标记引物进行PCR，扩增eaeA基因并同步在双链产物两端引入生物素与DIG。生物素端通过亲和素（Av-GEB）或链霉亲和素磁珠（m-GEC）高亲和力固定到换能器表面；DIG端再结合抗DIG-HRP酶标记物。在磷酸盐缓冲液中，HRP催化H2O2氧化对苯二酚（HQ）媒介体，电子经电极传递，在-0.15 V（vs Ag/AgCl）产生安培电流。细菌DNA浓度越高，PCR产物越多，固定和酶标记量越大，电流越大。m-GEC通过磁珠富集和快速分离未结合物，提高灵敏度。
检测灵敏度
LOD: m-GEC 0.45 ng l−1（10 cycles）、4.5 pg l−1（15 cycles）、0.45 pg l−1（20 cycles）；Av-GEB 4.5 ng l−1（10 cycles）、0.45 ng l−1（15 cycles）、4.5 pg l−1（20 cycles）；TaqMan Q-PCR 4.5 fg l−1（37 cycles）
效应效果
特异性方面，引物可扩增O157:H7、O157:Neg、O29:NM、O25:NM、O111:NM等致病血清型，不扩增非致病大肠杆菌；产物为112 bp单一条带，熔解温度72 ℃。灵敏度方面，m-GEC在10、15、20循环的检出限为0.45 ng l−1、4.5 pg l−1、0.45 pg l−1，Av-GEB为4.5 ng l−1、0.45 ng l−1、4.5 pg l−1；TaqMan Q-PCR为4.5 fg l−1（37循环）。对2 ng l−1模板，m-GEC和Av-GEB阈值循环为10和13，低于TaqMan的17和凝胶电泳的15；检测体积2.5和5 µL，比TaqMan的20 µL低4和8倍。未报告RSD、稳定性或回收率。作者认为其快速、低成本、高灵敏，适用于食源性致病菌筛查。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：石墨-环氧复合材料（GEC）工作电极，提供电化学换能；m-GEC为可磁捕获磁珠的磁敏GEC电极
- 识别/固定层（Av-GEB）：亲和素（avidin）整体掺入GEC形成Av-GEB生物复合材料，通过生物素-亲和素作用捕获5′-生物素标记扩增子
- 识别/固定层（m-GEC）：链霉亲和素修饰磁珠（Dynabeads M-280 Streptavidin）捕获5′-生物素标记扩增子，并被m-GEC电极磁捕获
- 识别元件：双标记eaeA基因PCR扩增子，5′端生物素（biotin）用于固定，3′端地高辛（DIG）用于酶标记
- 信号标记物：抗地高辛-辣根过氧化物酶（anti-Digoxigenin-HRP, antiDig-HRP）Fab片段，结合DIG端并催化底物
- 电子供体/介质：对苯二酚（hydroquinone, HQ）作为电子媒介体，H2O2作为HRP底物，在-0.15 V下产生安培电流
- 封闭/洗涤缓冲液：封闭Tris缓冲液（含2% BSA、0.1% Tween 20、5 mM EDTA）用于封闭非特异结合；5× SSC用于固定与洗涤
- 电化学系统：Ag/AgCl参比电极和铂辅助电极，与GEC工作电极组成三电极安培检测系统
中文摘要
本文报道了一种用于快速检测致病性大肠杆菌的高灵敏电化学基因传感方法。该方法通过PCR特异性扩增与大肠杆菌O157:H7致病性相关的eaeA基因片段，并采用TaqMan荧光定量PCR首先评估所设计引物的效率与选择性。随后，利用两种不同的电化学基因传感策略检测双标记PCR扩增产物：一种基于整体修饰亲和素生物复合材料（Av-GEB）的高选择性传感器，另一种基于链霉亲和素磁珠捕获的磁敏传感器（m-GEC）。两种策略均使用辣根过氧化物酶（HRP）作为酶标记物，通过安培法检测。结果表明，仅需10个PCR循环，Av-GEB和m-GEC分别可检测4.5 ng l−1和0.45 ng l−1的原始细菌基因组；与基于TaqMan探针的荧光定量PCR相比，电化学基因传感策略具有更高的灵敏度，为食源性致病菌的快速检测提供了有前景的方法。
英文摘要
A very sensitive assay for the rapid detection of pathogenic bacteria based on electrochemical genosensing has been designed. The assay was performed by the PCR specific amplification of the eaeA gene, related with the pathogenic activity of Escherichia coli O157:H7. The efficiency and selectivity of the selected primers were firstly studied by using standard Quantitative PCR (Q-PCR) based on TaqMan fluorescent strategy. The bacteria amplicon was detected by using two different electrochemical genosensing strategies, a highly selective biosensor based on a bulk-modified avidin biocomposite (Av-GEB) and a highly sensitive magneto sensor (m-GEC). The electrochemical detection was achieved in both cases by the enzyme marker HRP. The assay showed to be very sensitive, being able to detect 4.5 ng microl(-1) and 0.45 ng microl(-1) of the original bacterial genome after only 10 cycles of PCR amplification, when the first and the second strategies were used, respectively. Moreover, the electrochemical strategies for the detection of the amplicon showed to be more sensitive compared with Q-PCR strategies based on fluorescent labels such as TaqMan probes.