组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
细胞表面膜蛋白（cell-surface membrane proteins）：β2肾上腺素能受体（b2AR/ADRB2）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4/SLC2A4）、囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）；样品基质为活细胞培养物（NIH 3T3、C2C12、HEK 293 细胞）。
检测原理
该传感器基于 FAP 与荧光素的可逆非共价结合。FAP 被融合到目标膜蛋白的胞外 N 端或单跨膜蛋白的胞外端，使 FAP 仅当目标蛋白位于质膜胞外侧时暴露于细胞外环境。加入膜不通透荧光素（MG-11P 或 TO1-2P）后，荧光素不能穿过质膜，只能与表面 FAP 结合；结合使荧光素荧光大幅增强，形成表面荧光信号。若目标蛋白位于内体、高尔基体等胞内区室，膜不通透荧光素无法接触 FAP，相应位置保持暗；使用膜通透 MG-ester 时，荧光素可进入胞内区室并标记内体膜系统。激动剂刺激 b2AR 内吞后，表面 FAP-荧光素复合物随受体进入胞内，表面荧光下降、胞内荧光出现。因此，荧光强度与位置反映目标蛋白在质膜上的暴露程度及转运动态。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
在 NIH 3T3、C2C12 和 HEK 293 细胞中，FAP 融合蛋白稳定表达。膜不通透荧光素下 FAP 信号仅出现在细胞表面；EGFP/mRFP 或膜通透 MG-ester 显示胞内分布，说明 FAP 能区分质膜暴露蛋白与内体蛋白。与 GFP 标记相比，FAP 可避免胞内背景干扰，并优于 TIRF 对距表面约 100 nm 囊泡的分辨限制。与 FlAsH/ReAsH、SNAP/Halo、生物素连接等相比，FAP 只需添加一种可溶荧光素，无需多步洗涤或分离。40 nM 荧光素孵育 5–10 min 达到信号饱和；100 nM TO1-2P 与 10 μM isoproterenol 处理 40 min 可观察到 b2AR 内吞。作者认为该体系可用于膜蛋白转运监测、药物筛选及高通量流式/荧光计检测。
传感器的构成
- 成像基底：玻璃底培养皿（Mattek 35 mm glass-bottom dishes），承载细胞并用于共聚焦荧光成像。
- 细胞基质：哺乳动物细胞（NIH 3T3、C2C12、HEK 293），表达 FAP 融合膜蛋白并提供活细胞环境。
- 质膜定位层：PDGFRB 跨膜域或天然多跨膜蛋白（b2AR、GLUT4、CFTR），将 FAP 锚定在质膜胞外侧。
- 识别/报告元件：FAP（HL4-MG 或 HL1.1-TO1），特异性结合对应荧光素并在结合后增强荧光。
- 目标膜蛋白：b2AR（ADRB2）、GLUT4（SLC2A4）、CFTR，作为被检测/被追踪的细胞表面蛋白。
- 信号标记物：膜不通透荧光素 MG-11P 或 TO1-2P，仅标记胞外暴露 FAP；膜通透 MG-ester 可标记内体膜系统。
- 对照荧光蛋白：EGFP 或 mRFP，位于胞内侧，显示融合蛋白总分布。
- 刺激配体：异丙肾上腺素（isoproterenol），刺激 b2AR 内吞以监测动态转运。
- 读出装置：共聚焦荧光显微镜（Carl Zeiss LSM 510 Meta/UV DuoScan、Olympus IX50 旋转盘共聚焦），记录荧光强度与亚细胞位置。
中文摘要
本研究探索了一类新型生物传感器的通用价值，该传感器可选择性可视化位于细胞表面的特定膜蛋白分子。该体系利用近期报道的双组分荧光模块，由荧光激活蛋白（FAP）和小分子荧光素组成；荧光素在与 FAP 非共价结合后荧光显著增强。作者构建了表达单跨膜重组膜蛋白的细胞，其质膜外侧展示 FAP，胞内侧展示 EGFP 或 mRFP，并用荧光显微镜观察。使用膜不通透荧光素成像 FAP 域时，荧光信号仅出现在细胞表面；而成像荧光蛋白域时，信号还出现在胞内其他位置。作者还构建了在人 β2 肾上腺素能受体（b2AR）、胰岛素调控葡萄糖转运蛋白（GLUT4）和囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）胞外 N 端融合 FAP 的细胞；暴露于膜不通透荧光素后，这些细胞同样仅在细胞表面显示荧光。进一步地，在荧光素存在下用激动剂刺激标记 b2AR 的内吞作用时，荧光信号从细胞表面转移至胞内。因此，FAP 标记为选择性观察质膜蛋白并监测这些蛋白进出细胞表面的转运提供了手段。
英文摘要
This study explores the general utility of a new class of biosensor that allows one to selectively visualize molecules of a chosen membrane protein that are at the cell surface. These biosensors make use of recently described bipartite fluoromodules comprised of a fluorogen-activating protein (FAP) and a small molecule (fluorogen) whose fluorescence increases dramatically when noncovalently bound by the FAP (Szent-Gyorgyi et al., Nat Biotechnol 2010;00:000-000).