组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
磺酰胺类碳酸酐酶II抑制剂（sulfonamide-based CAII inhibitors）、腺苷二磷酸（ADP）、小分子片段化合物（fragment compounds）、蔗糖（sucrose，浓度梯度参考）；样品基质为HBS缓冲液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4），ADP/片段筛选含10 mM MgCl2和3% DMSO
检测原理
FastStep将缓冲液与样品流在流池前混合，由双注射泵自动产生二倍或三倍浓度阶梯。靶蛋白（CAII或激酶）经生物素-链霉亲和素固定于COOH5 SPR芯片，小分子分析物结合后改变金膜界面折射率，SPR仪器以共振单位（RU）读出结合量。蔗糖作为高折射率参考，其响应曲线用于定义结合相中任意时间点的分析物浓度；Qdat软件将该梯度自动应用于分析物数据，并全局拟合1:1模型获得ka、kd和KD。信号随分析物浓度升高而增大，平衡响应反映结合量，无需荧光或酶标记放大。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
蔗糖FastStep二倍/三倍梯度七次重复标准偏差<0.3%，机械步进高度可重复。标准注射与FastStep对磺胺和CBS结合CAII得到相同结合常数；8个磺酰胺抑制剂KD覆盖0.000112–39 μM，与ProteOn XPR36和Biacore基准一致。ADP与激酶标准注射KD为43±6 μM，FastStep重复平均41±2 μM；CAII阴性对照无可靠结合，显示选择性。320片段筛选约24 h完成，ADP每96样品后信号降低约20%，反映激酶表面活性衰减，但每个浓度系列独立拟合，不影响亲和力测定。该方法减少样品制备、节省板孔并提高通量，适合SPR片段初级与二级筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器：COOH5 sensor chip，SPR金膜羧基芯片，提供表面等离子共振检测与羧基偶联位点
- 活化层：EDC与sulfo-NHS，活化芯片羧基以偶联链霉亲和素氨基
- 捕获层：streptavidin，固定于芯片表面，用于捕获生物素化靶蛋白
- 识别元件：biotinylated carbonic anhydrase II (CAII)或target kinase，通过生物素-链霉亲和素结合捕获，提供小分子结合位点
- 封闭层：1 M ethanolamine (pH 8.9)，封闭未反应氨基，降低非特异结合
- 分析物/信号源：unlabeled small molecules（sulfonamide inhibitors、ADP、fragment compounds）或20% sucrose，结合或折射率变化产生SPR信号
- 流动相：HBS（10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4），ADP/片段筛选含10 mM MgCl2和3% DMSO
- 仪器/读出：SensíQ Pioneer SPR instrument与Qdat software，双注射泵自动混合缓冲液/样品并读出共振单位
中文摘要
本文报道了一种用于SensíQ Pioneer表面等离子共振（SPR）生物传感器的新型分析物注射方法，称为FastStep。该方法通过在反应流池入口前立即合并缓冲液流和样品流，使仪器能够仅从单个分析物样品自动产生二倍或三倍稀释系列，分别包含七个或五个浓度，从而覆盖约100倍浓度范围。作者利用蔗糖注射证明各浓度阶梯在起始时间和响应水平上高度可重复，整体响应曲线标准偏差小于0.3%。针对动力学研究，作者开发了分析软件，利用蔗糖的折射率响应自动定义结合相中任意时间点的分析物浓度，并在全局拟合1:1相互作用模型时自动应用该浓度梯度。为验证方法，作者比较了标准注射与FastStep注射下ADP与靶激酶的结合，以及一组磺酰胺类化合物与碳酸酐酶II的结合，结果显示两种方法获得的结合常数在实验误差内一致，并与ProteOn和Biacore平台数据相符。最后，作者展示了FastStep可用于片段库初级筛选，在约24小时内完成320个化合物的完整浓度系列检测，提高通量并减少样品制备时间。
英文摘要
We have developed a novel analyte injection method for the SensíQ Pioneer surface plasmon resonance-based biosensor referred to as "FastStep." By merging buffer and sample streams immediately prior to the reaction flow cells, the instrument is capable of automatically generating a two- or threefold dilution series (of seven or five concentrations, respectively) from a single analyte sample. Using sucrose injections, we demonstrate that the production of each concentration within the step gradient is highly reproducible. For kinetic studies, we developed analysis software that utilizes the sucrose responses to automatically define the concentration of analyte at any point during the association phase. To validate this new approach, we compared the results of standard and FastStep injections for ADP binding to a target kinase and a panel of compounds binding to carbonic anhydrase II. Finally, we illustrate how FastStep can be used in a primary screening mode to obtain a full concentration series of each compound in a fragment library.