组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
bar gene（草铵膦除草剂抗性基因）特异性DNA片段；样品基质：植物/转基因食品来源DNA（实验为缓冲液中的寡核苷酸靶DNA）
检测原理
传感器以硬脂酸修饰碳糊电极为基底，19-mer单链DNA探针通过乙二胺共价固定于电极表面。样品中bar基因互补DNA与探针杂交后形成双链DNA，改变电极界面结构。三(2,2′-联吡啶)钴(III)指示剂Co(bpy)3^3+对双链DNA的亲和力高于单链DNA，杂交后更多指示剂结合于电极表面，其氧化还原峰电流随靶DNA浓度升高而增大，5–20 μM范围内线性。该过程主要依赖金属配合物与DNA磷酸骨架的静电相互作用，双链结合使Co(bpy)3^3+峰电位负移。也可直接测量鸟嘌呤氧化峰，但灵敏度较低。未采用HCR、RCA等核酸放大策略。
检测灵敏度
LOD: 0.1 μM；线性范围: 5–20 μM；文中另报告 LOD: 0.05 μM；鸟嘌呤法 LOD: 1 μM；线性范围: 3–10 μM
效应效果
选择性方面，5 μM非互补DNA产生的Co(bpy)3^3+信号仅略高于未杂交探针，且显著低于0.1 μM互补靶DNA信号，说明传感器可区分互补与非互补序列，但存在一定非特异相互作用。重现性方面，Co(bpy)3^3+信号RSD为4%–8%（5 μM靶DNA时4%，20 μM时6%），而鸟嘌呤信号RSD超过20%。洗涤时间影响重现性，3 min洗涤可获得较好重现性。杂交时间优化为15 min，单次完整分析约70 min。电极可通过更新外层碳糊再生。论文未与ELISA、qPCR等现有方法直接对比，作者认为该传感器可用于转基因植物来源真实样品中bar基因的简单、快速、可靠检测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：碳糊电极（CPE），石墨粉与矿物油70:30，外层含5% (w/w)硬脂酸，提供导电基底和羧基位点
- 羧基活化层：EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺）与NHS（N-羟基磺基琥珀酰亚胺）活化硬脂酸羧基，用于形成酰胺键
- 连接臂：乙二胺（ethylenediamine），与活化羧基反应形成酰胺连接，为DNA探针提供共价固定位点
- 识别元件：19-mer单链DNA探针（5′-GTCAACTTCCGTACCGAGC），通过5′-磷酸端共价固定，特异性识别bar基因互补序列
- 杂交靶物：bar基因互补19-mer DNA（5′-GCTCGGTACGGAAGTTGAC），与探针杂交形成双链DNA
- 信号指示剂：三(2,2′-联吡啶)钴(III)高氯酸盐Co(bpy)3^3+，与双链DNA结合更强，产生可测氧化还原信号
- 读出系统：三电极体系（CPE工作电极、Ag/AgCl参比电极、铂丝对电极）与PGSTAT12电位计，采用方波伏安法（SWV）读取峰电流
中文摘要
本文报道了一种用于检测编码草铵膦除草剂抗性的bar基因的电化学生物传感器。该传感器以碳糊电极为基底，外层掺入硬脂酸提供羧基，通过EDC和NHS活化后，利用乙二胺将特异性19-mer单链DNA探针经5′-磷酸端共价固定于电极表面。样品中与bar基因互补的DNA片段与探针杂交形成双链DNA。杂交事件通过三(2,2′-联吡啶)钴(III)指示剂Co(bpy)3^3+检测，该指示剂与双链DNA的结合能力强于单链DNA，使方波伏安氧化还原峰电流随靶DNA浓度增加。传感器对靶DNA的检测限为0.1 μM，线性范围为5–20 μM。也可通过鸟嘌呤氧化峰检测杂交，但检测限约为1 μM且重现性较差。包括探针固定、杂交和指示剂作用在内的单次测量约70 min。
英文摘要
An electrochemical biosensor for the detection of bar gene coding phosphinothricin herbicide resistance is presented. The detection was based on hybridization reaction between the specific to bar gene 19-mer probe immobilized on the electrode surface and complementary DNA in a sample. Single-stranded DNA probe specific to bar gene was covalently attached by 5'-phosphate end to the surface of carbon paste electrode. Outer layer of a conventional CPE was provided with carboxyl groups of stearic acid. ssDNA was coupled to the electrode through ethylenediamine with the use of water-soluble 1-ethyl-3(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimide and N-hydroxy-sulfosuccinimide as activating reagents. Hybridization reaction at the electrode surface was detected via Co(bpy)(3)(3+), which possess a much higher affinity to the resulting DNA duplex compared to ssDNA probe. Detection limit of the sensor was 0.1 microM of target DNA fragments and its response was linear from 5 to 20 microM. Hybridization event was also detected by measuring guanine peak but this approach presented distinctly higher detection limit (1 muM) and lower reproducibility. Complete time of one measurement with the use of the biosensor including covalent attachment of ethylenediamine (linker) and ssDNA probe to the electrode, hybridization with target and interaction with electroactive indicator was about 70 min.