组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
硝酸盐（nitrate, NO3−）；实验样品基质为除氧0.1 M Tris–HCl缓冲液（pH 7.5），应用面向环境水样/饮用水
检测原理
硝酸还原酶（NR）被包埋于皂石粘土（laponite）凝胶中并用戊二醛交联，水溶性吡咯–紫精单体1在粘土层间电聚合形成固定化氧化还原介体poly1。在−0.60 V下，电极将紫精二价阳离子还原为自由基阳离子（MV+），MV+通过扩散或电子跳跃到达NR活性中心并被NR氧化回MV2+；同时NR催化NO3−+H2O+2e−→NO2−+2OH−。NO3−浓度升高使酶促电子传递速率增加，从而产生增强的阴极催化电流。旋转圆盘条件下电流受NO3−传质与酶动力学共同控制，可用Koutecky–Levich和Michaelis–Menten模型解析。信号放大来自酶催化循环与紫精介体的多次电子穿梭。
检测灵敏度
相关系数: 0.987–0.999；0.99
效应效果
该传感器在除氧0.1 M Tris–HCl缓冲液中表现出稳定的可逆紫精氧化还原峰，加入2 mM NO3−后在−0.60 V出现强阴极催化电流，表明NR保持活性且poly1实现有效电连接。旋转圆盘实验得到k2=10.7 s−1、KM=7 μM，电化学Lineweaver–Burk表观KM为16 μM，说明酶对硝酸盐亲和力较高；k2低于Willner报道的4.7×10^4 s−1，可能源于粘土凝胶包埋的空间限制，但仍与电连接酶传感器相当。文中未报告实际水样加标回收率、RSD、选择性或抗干扰数据，作者主张粘土模板与电生成氧化还原聚合物可用于开发固定化酶生物传感器。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：玻璃碳盘电极（GCE），提供电子传导与电极表面
- 导电聚合物底层：疏水性吡咯–紫精单体2（monomer 2）电聚合形成的聚吡咯–紫精膜（poly2），增强电极与氧化还原聚合物间电子通信
- 粘土/酶固定层：皂石粘土（laponite，合成hectorite）与硝酸还原酶（NR）混合干燥形成的粘土凝胶涂层，包埋并固定NR
- 交联剂：戊二醛（glutaraldehyde, GA），交联包埋的NR以提高稳定性
- 识别元件：硝酸还原酶（NR），催化NO3−还原为NO2−
- 信号标记/电子介体：水溶性吡咯–紫精单体1（monomer 1）在粘土–NR层间电聚合形成的聚吡咯–紫精膜（poly1），作为固定化氧化还原介体
- 电子供体/还原态介体：紫精自由基阳离子（MV+），在电极与NR间传递电子
- 电解质/缓冲层：0.1 M Tris–HCl（pH 7.5），提供离子导电与酶活性环境
中文摘要
将硝酸还原酶（NR）包埋于皂石粘土凝胶中，并用戊二醛进行交联固定。在硝酸盐和甲基紫精存在下，电极在−0.60 V处出现催化电流，表明游离甲基紫精的还原态介导了NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐的电酶反应。随后，在宿主粘土基质的层间空间和通道内电聚合一种水溶性吡咯–紫精衍生物，成功实现了对包埋NR的电连接，避免了游离紫精介体流失。通过旋转圆盘电极实验测定了动力学常数，得到k2=10.7 s−1和KM=7 μM。这些参数分别反映了电酶还原硝酸盐的催化效率以及固定化酶对底物的亲和力，说明粘土模板与导电聚合物复合结构有利于保持酶活性并实现有效电子传递。
英文摘要
The immobilization of nitrate reductase (NR) was performed by entrapment in a laponite clay gel and cross-linking by glutaraldehyde. In presence of nitrate and methyl viologen, a catalytic current appeared at -0.60 V illustrating the enzymatic reduction of nitrate into nitrite via the reduced form of the freely diffusing methyl viologen. The electropolymerization of a water-soluble pyrrole viologen derivative within the interlamellar spaces and channels of the host clay matrix successfully carried out the electrical wiring of the entrapped NR. Rotating disk measurements led to the determination of kinetic constants, namely k(2)=10.7 s(-1) and K(M)=7 microM. These parameters reflect the efficiency of the electro-enzymatic reduction of nitrate and the substrate affinity for the immobilized enzyme.