组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
钙离子（calcium ions, Ca2+）、钙调蛋白抑制剂（calmodulin inhibitors，如三氟哌嗪 trifluoroperazine TFP、黄烷酮类 xanthones 1–8）；样品基质：醋酸钾缓冲液溶液及真菌 Emericella 25379 提取物纯化化合物溶液。
检测原理
该传感器以工程化 hCaM 为生物识别元件，Cys39 和 Cys91 共价连接 mBBr 荧光团。未结合状态下两个 mBBr 相距较远；Ca2+ 结合后 hCaM 由半开放构象转变为开放构象，引起荧光增强。TFP 或黄烷酮类抑制剂结合后，蛋白构象改变使两个荧光团相互靠近，发生荧光猝灭。荧光变化幅度与配体浓度相关，通过激发 381 nm、检测 415–550 nm 发射，按结合方程拟合得到 Kd 和化学计量比。双 mBBr 标记将量子产率从野生型的 0.025 提高到 0.514，从而提高信噪比和检测灵敏度，无需酶促或核酸放大。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该传感器在常规储存条件下稳定，并在多次检测中保持良好稳定性；可保留野生型 hCaM 功能，在体外激活 PDE1。同一体系可同时检测 Ca2+ 和 CaM 抑制剂，具有较高特异性和灵敏度，样品用量少，适合定性与定量分析。Ca2+ 表观 Kd 为 0.24 μM ± 0.03，化学计量比 4.10 ± 0.15；TFP 的 Kd 约为 5.74 ± 0.53 μM（随 Ca2+ 饱和程度变化），化学计量比约 2:1。黄烷酮 1–5、7、8 对 (Ca2+)4-CaM 的 Kd 为 4–498 nM，其中 2、7、1 分别为 3.7、6.8、28.7 nM，优于多数 μM 级经典抑制剂。作者认为其可用于筛选新 CaM 抑制剂并研究 Ca2+ 变构效应。
传感器的构成
- 溶液相基底：醋酸钾缓冲液（potassium acetate buffer，pH 5.1/5.5，37 °C），作为无固定基底的溶液相检测介质，维持 hCaM 构象。
- 生物识别元件：重组人钙调蛋白 hCaM（human calmodulin），由 CALM1 基因经 pET12b/pET13b 载体在 E. coli BL21-AI 中表达，L39C/V91C 突变提供两个特异性 Cys 位点。
- 荧光标记层：单溴双咪胺 monobromobimane（mBBr）与 Cys39 和 Cys91 巯基共价结合，形成 hCaM L39C-mBBr/V91C-mBBr，作为外源荧光报告基团。
- 被测物/配体：Ca2+（CaCl2）或钙调蛋白抑制剂（如 trifluoroperazine TFP、黄烷酮类 xanthones 1–8），与 hCaM 结合引起构象变化。
- 信号读出装置：ISS-PC1 荧光分光光度计（spectrofluorometer），激发 381 nm、发射 415–550 nm，检测荧光增强或猝灭。
中文摘要
本文构建了一种新型、敏感且特异的人钙调蛋白（hCaM）荧光生物传感器 hCaM L39C-mBBr/V91C-mBBr。该传感器可用于在溶液中检测具有相反荧光信号的配体，即钙离子（Ca2+）和钙调蛋白抑制剂。作者将该装置成功应用于分析 Ca2+ 对三氟哌嗪（TFP）结合 CaM 的变构效应：Ca2+ 的表观解离常数 Kd 为 0.24 μM ± 0.03，化学计量比为 4.10 ± 0.15；TFP 的 Kd 约为 5.74 ± 0.53 μM，随 Ca2+ 饱和程度变化，化学计量比为 2:1。此外，该传感器还适用于从真菌 Emericella 25379 中发现具有抗 CaM 活性的新黄烷酮类化合物 5、6 和 8。化合物 1–5、7 和 8 对 (Ca2+)4-CaM 复合物的亲和力优异，实验 Kd 处于纳摩尔范围（4–498 nM）。分子对接分析预测 1–8 与 TFP 类似，结合于 CaM 的 I、III 和 IV 位点。
英文摘要
A novel, sensible, and specific fluorescent biosensor of human calmodulin (hCaM), namely hCaM L39C-mBBr/V91C-mBBr, was constructed. The biosensor was useful for detecting ligands with opposing fluorescent signals, calcium ions (Ca(2+)) and CaM inhibitors in solution. Thus, the device was successfully applied to analyze the allosteric effect of Ca(2+) on trifluoroperazine (TFP) binding to CaM (Ca(2+)K(d) = 0.24 μM ± 0.03 with a stoichiometry 4.10 ± 0.15; TFPK(d) ∼ 5.74-0.53 μM depending on the degree of saturation of Ca(2+), with a stoichiometry of 2:1). In addition, it was suitable for discovering additional xanthones (5, 6, and 8) with anti-CaM properties from the fungus Emericella 25379. The affinity of 1-5, 7, and 8 for the complex (Ca(2+))(4)-CaM was excellent because their experimental K(d)s were in the nM range (4-498 nM). Docking analysis predicted that 1-8 bind to CaM at sites I, III, and IV as does TFP.