组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
酪蛋白胶束（casein micelle）及其中 αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白（caseins），样品基质为脱脂生乳分离胶束、咪唑缓冲液分散胶束、EDTA 溶解酪蛋白及 UHT 乳蛋白水解样品
检测原理
CM5 芯片经 EDC/NHS 活化后共价固定兔抗鼠抗体（RAM），再注入酪蛋白特异性单克隆抗体（mAb）形成捕获层。将酪蛋白胶束或 EDTA 溶解酪蛋白注入流动池，mAb 与胶束表面可及表位发生特异性结合。结合事件使传感器表面质量增加，改变金膜表面等离子体共振条件，Biacore 3000 以共振单位（RU）实时记录结合、解离曲线。信号大小取决于表位暴露程度、抗体结合容量和胶束浓度；在 0.5–2 μg/mL 酪蛋白浓度范围内，所选抗体呈线性响应。由于酪蛋白胶束分子量远高于单体酪蛋白，单个胶束被抗体捕获可产生较高 RU，从而无需化学标记即可比较不同表位可及性。
检测灵敏度
线性范围: 0.5–2 μg/mL（酪蛋白浓度，所选抗体）
效应效果
实验重复性良好，重复分析标准偏差为 0.4%–4.1%；参考通道扣除后非特异结合低于特异信号的 3.2%。44 种单抗对纯酪蛋白的结合容量为 14%–147%，其中 β-酪蛋白平均 63%（SD 29%），αs1-酪蛋白 43%（SD 20%），αs2-和 κ-酪蛋白均约 90%。SPR 结果显示 κ-酪蛋白 C 末端表位高度可及且复合物稳定，αs2-酪蛋白可及性低且复合物易解离。EDTA 破坏胶束后，αs1-和 αs2-酪蛋白疏水区域信号增加，κ-酪蛋白信号大幅下降。蛋白水解实验中，κ-酪蛋白 C 末端信号快速下降，αs1-和 αs2-酪蛋白部分疏水区域信号上升。作者认为该 SPR 免疫传感器可作为酪蛋白胶束表面分子探针，用于验证胶束结构模型。
传感器的构成
- SPR 基底：CM5 传感器芯片（羧甲基葡聚糖层，提供羧基表面并支持 SPR 换能）
- 化学活化层：EDC/NHS 活化羧基，用于兔抗鼠抗体共价偶联
- 捕获抗体层：兔抗鼠抗体（RAM），共价固定于 CM5，用于捕获酪蛋白特异性单克隆抗体
- 识别元件：44 种酪蛋白特异性单克隆抗体（mAb），识别 αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白不同表位
- 被测物层：酪蛋白胶束（casein micelle）或 EDTA 溶解酪蛋白，与 mAb 结合
- 信号读出：无标记 SPR 共振单位（RU）变化，由 Biacore 3000 实时监测
- 再生清洗：100 mM 甘氨酸-HCl（pH 1.7）与 10 mM NaOH，解离抗原—抗体复合物
- 运行缓冲液：20 mM 咪唑、50 mM NaCl、5 mM CaCl2（pH 6.7），维持胶束天然结构
中文摘要
酪蛋白胶束是牛乳中由 αs1-、αs2-、β- 和 κ-酪蛋白及胶体磷酸钙组成的超分子胶体颗粒，但其表面四种酪蛋白的精确排布仍不清楚。本研究利用表面等离子共振（SPR）生物传感器，在实时、无标记条件下，系统监测 44 种分别识别 αs1-、αs2-、β- 和 κ-酪蛋白不同表位的单克隆抗体与酪蛋白胶束的结合。结果表明，四种酪蛋白均可被相应抗体识别，但 κ-酪蛋白 C 末端高度暴露并位于胶束外围，形成稳定抗原—抗体复合物；αs2-酪蛋白可及性较低，复合物稳定性较差。当用 EDTA 破坏胶束结构后，αs1- 和 αs2-酪蛋白疏水区域的可及性增加，而 κ-酪蛋白信号显著下降。在荧光假单胞菌蛋白酶作用下，κ-酪蛋白 C 末端被快速水解，胶束结构开放使其他酪蛋白疏水区域更易被抗体识别。该 SPR 免疫传感方法为解析酪蛋白胶束表面拓扑和验证结构模型提供了有效工具。
英文摘要
Several theoretical models of the casein micelle structure have been proposed in the past, but the exact organization of the four individual caseins (α(s1), α(s2), β, and κ) within this supramolecular structure remains unknown. The present study aims at determining the topography of the casein micelle surface by following the interaction between 44 monoclonal antibodies specific for different epitopes of α(s1)-, α(s2)-, β-, and κ-casein and the casein micelle in real time and no labeling using a surface plasmon resonance (SPR)-based biosensor. Although the four individual caseins were found to be accessible for antibody binding, data confirmed that the C-terminal extremity of κ-casein was highly accessible and located at the periphery of the structure. When casein micelles were submitted to proteolysis, the C-terminal extremity of κ-casein was rapidly hydrolyzed. Disintegration of the micellar structure resulted in an increased access for antibodies to hydrophobic areas of α(s1)- and α(s2)-casein.