组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
FAK 激酶活性（focal adhesion kinase activity, FAK activity；Tyr397 磷酸化），样品基质：活细胞（小鼠胚胎成纤维细胞 MEFs 的质膜/DRM 微区）及体外纯化蛋白体系。
检测原理
该传感器以 FAK 激酶活性为检测对象。活细胞或体外体系中，FAK 在 ATP 存在下磷酸化传感器内 FAK 底物肽 ETDDYAEIIDE 的 Tyr397；磷酸化酪氨酸随后与分子内 c-Src SH2 结构域结合，使 ECFP 与 YPet 的相对距离或取向改变，FRET 效率降低。由于供体 ECFP 发射增强而受体 YPet 发射减弱，ECFP/YPet 发射比升高，且升高幅度随局部 FAK 活性增强而增大。Lyn 或 KRas 脂质标签将传感器分别锚定到 DRM 或非 DRM 膜微区，从而通过荧光显微镜 FRET 比值成像实现亚细胞空间分辨。该设计不含 FAK 激酶域，避免外源激酶干扰；PF228 可特异性抑制响应，Y397F 突变消除响应，保证信号来自 FAK 介导的 Tyr397 磷酸化。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
体外传感器经 FAK 孵育后 ECFP/YPet 比值变化约 90%，可被 PF228 或 Y397F 突变消除，Src 不引起响应，显示 FAK 特异性。细胞中，黏附纤连蛋白的 MEF 比值高于悬浮细胞，FAK−/− 无响应；活性 FAK 或野生型 FAK 诱导响应，FAK NT、FAK KD、空载体及 Src WT 不诱导，YF/RV 突变体无响应。Lyn–FAK 黏附响应高于 KRas–FAK，PF228 使 Lyn–FAK 比值由 1.1 降至 0.9，MβCD 仅降低 Lyn–FAK。PDGF 刺激 10 min 内 Lyn–FAK 升高 15–20%，KRas–FAK <5%；PP1 阻断 PDGF 响应，LY294002 不影响 FAK/Src。作者认为其可高时空分辨监测膜微区 FAK 活性。
传感器的构成
- 荧光供体/换能层：ECFP，位于N端，作为FRET供体，发射478 nm荧光。
- 识别元件层：c-Src SH2结构域，识别并结合FAK底物肽Tyr397磷酸化产物，引起构象变化。
- 柔性连接层：GSTSGSGKPGSGEGS，连接SH2与底物肽，提供构象柔性。
- 底物识别层：FAK底物肽ETDDYAEIIDE（含Tyr397），被FAK磷酸化，是识别事件发生位点。
- 荧光受体/换能层：YPet，位于C端，作为FRET受体，发射526 nm荧光。
- DRM靶向修饰层：Lyn标签MGCIKSKRKDNLNDDE，经肉豆蔻酰化/棕榈酰化将传感器锚定于DRM微区。
- 非DRM靶向修饰层：KRas标签KKKKKKSKTKCVIM，经法尼基化及多碱性区将传感器锚定于非DRM膜区。
- 信号读出层：ECFP/YPet发射比，FRET降低时比值升高，表示FAK活性增强。
中文摘要
细胞黏附激酶（FAK）的正确亚细胞定位对细胞黏附、迁移和力学转导等过程至关重要，但其在不同膜微区中的活性调控机制仍不清楚。为在活细胞中可视化不同膜微区的 FAK 活性，作者开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的 FAK 生物传感器，并通过脂质修饰将其靶向至去垢剂抵抗膜（DRM）区域或非 DRM 区域。结果显示，在细胞黏附到细胞外基质蛋白或血小板源性生长因子（PDGF）刺激下，靶向 DRM 的 FAK 生物传感器 FRET 响应强于非 DRM 区域，提示 FAK 激活可发生在 DRM 微区。进一步实验表明，PDGF 诱导的 FAK 激活由 Src 激酶活性介导并维持；而细胞黏附诱导的 FAK 激活不依赖 Src 活性，并且是 Src 激活所必需的。因此，FAK 在不同膜微区中可通过不同分子机制响应不同生理刺激。
英文摘要
Proper subcellular localization of focal adhesion kinase (FAK) is crucial for many cellular processes. It remains, however, unclear how FAK activity is regulated at subcellular compartments. To visualize the FAK activity at different membrane microdomains, we develop a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based FAK biosensor, and target it into or outside of detergent-resistant membrane (DRM) regions at the plasma membrane. Here we show that, on cell adhesion to extracellular matrix proteins or stimulation by platelet-derived growth factor (PDGF), the FRET responses of DRM-targeting FAK biosensor are stronger than that at non-DRM regions, suggesting that FAK activation can occur at DRM microdomains. Further experiments reveal that the PDGF-induced FAK activation is mediated and maintained by Src activity, whereas FAK activation on cell adhesion is independent of, and in fact essential for the Src activation. Therefore, FAK is activated at membrane microdomains with distinct activation mechanisms in response to different physiological stimuli.