A FRET-Based Biosensor for the Src N-Terminal Regulatory Element.
在信号转导蛋白中，内在无序区常作为调控元件，对环境变化、配体结合和翻译后修饰敏感。无序区所采样的构象空间可受环境刺激影响，并通过效应结构域触发下游过程。这类调控元件的无序性使其能够整合信号并产生分级响应，但也阻碍了基于固定三维结构的传统药物筛选方法。作者设计了一种可遗传编码的生物传感器，用于检测 c-Src 激酶 N 端调控元件（S...
Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Intercellular Mechanotransmission upon Wounding.
在细胞间通讯中，物理与生化线索的相互作用对信息交换和功能协调至关重要，但在单个活细胞中可视化细胞间信号动态仍具挑战。本文报道一种基于激光微剪刀和 Förster 共振能量转移（FRET）显微镜的光学方法，用于研究细胞间信号传递。首先，利用高通量筛选平台开发了高灵敏 FRET 生物传感器 SCAGE，用于监测细胞间相互作用和信号级联的...
Cysteine-Mediated Redox Regulation of Cell Signaling in Chondrocytes Stimulated With Fibronectin Fragments.
目的：氧化翻译后修饰可能调控关节炎软骨破坏相关信号通路。本研究检测骨关节炎（OA）软骨细胞中半胱氨酸氧化形成亚磺酸（S-亚磺酸化），并在正常软骨细胞中探讨纤连蛋白片段（FN-f）刺激软骨细胞分解代谢信号的机制。方法：从OA和正常人关节软骨分离软骨细胞，使用与蛋白S-亚磺酸化半胱氨酸特异性不可逆反应的二甲基环己二酮类似物进行分析。通过...
RhoA and membrane fluidity mediates the spatially polarized Src/FAK activation in response to shear stress.
Src 激酶在剪切应力诱导的血管细胞反应中起关键作用，但高剪切应力（HSS）诱导 Src 激活的亚细胞时空模式仍不清楚。本研究对牛主动脉内皮细胞（BAECs）施加 65 dyn/cm2 的 HSS，利用基于荧光共振能量转移（FRET）的膜靶向 Src 生物传感器 Kras-Src，在亚细胞水平实时可视化 Src 激酶活性。结果显示，...
Electroporation-delivered fluorescent protein biosensors for probing molecular activities in cells without genetic encoding.
荧光蛋白生物传感器通常依赖遗传编码，需要转染质粒并在细胞内表达，因而难以应用于数量稀少、难以转染的原代细胞样本。本研究采用电穿孔将蛋白形式的FRET荧光蛋白生物传感器直接递送至细胞内，无需质粒转染和表达。作者以ECFP/YPet Src FRET报告子为模型，在PDMS微流控通道中完成电穿孔递送、细胞培养与荧光成像。该报告子由Src...
Graphene based electrochemical biosensor for label-free measurement of the activity and inhibition of protein tyrosine kinase.
本文报道了一种基于石墨烯修饰玻璃碳电极（G/GCE）的简单、超灵敏、无标记电化学方法，用于评价蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性及其抑制。石墨烯可通过电催化氧化反应增强酪氨酸（Tyr）残基的电化学响应；激酶催化磷酸化后，磷酸化酪氨酸（pTyr）呈电不活性，使 Tyr 氧化电流降低。因此，肽中 Tyr 残基的电化学信号可作为内源信号报告物，...
Intravital FLIM-FRET imaging reveals dasatinib-induced spatial control of src in pancreatic cancer.
癌症侵袭与转移发生在复杂三维环境中，并受周围宿主组织与血管的反馈调控。本研究建立了一种新型活体成像方法，用于揭示抗侵袭Src抑制剂dasatinib处理后Src活性的时空调控。作者采用基于荧光寿命成像显微镜–荧光共振能量转移（FLIM-FRET）的Src生物传感器，在p53突变转基因胰腺癌小鼠模型中实时监测药物靶向效力。与传统固定终...
Monitoring biosensor activity in living cells with fluorescence lifetime imaging microscopy.
活细胞显微成像现已常规用于监测基因编码生物传感器蛋白的活性，以直接测量细胞、组织或生物体内特定信号事件。多数荧光生物传感器蛋白依赖 Förster 共振能量转移（FRET）报告信号事件引起的蛋白构象变化，通常用基于强度的比率成像测量。荧光寿命成像显微镜（FLIM）是另一种监测 FRET 型生物传感器蛋白活性的方法。FLIM 在时域测...
Real-time imaging elucidates the role of H2O2 in regulating kinetics of epidermal growth factor-induced and Src-mediated tyrosine phosphorylation signaling.
可逆氧化是蛋白酪氨酸磷酸化调控的重要机制。生长因子刺激后产生的过氧化氢（H2O2）被认为可抑制蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）活性，从而使蛋白酪氨酸激酶（PTK）提高蛋白酪氨酸磷酸化稳态水平，推动信号传播。然而，H2O2对酪氨酸磷酸化信号动力学的影响，尤其在活细胞中，仍不清楚。本研究采用基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码Src激酶...
Nitric oxide-dependent Src activation and resultant caveolin-1 phosphorylation promote eNOS/caveolin-1 binding and eNOS inhibition.
内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的一氧化氮（NO）对血管功能调节至关重要。caveolin-1（Cav-1）结合eNOS可使其失活，但Cav-1抑制已激活eNOS的机制不清。本研究探讨Src依赖的Cav-1磷酸化在eNOS负反馈中的作用。利用荧光共振能量转移（FRET）和共免疫沉淀（coIP），作者发现内皮细胞经凝血酶、血管内皮生...
Reusable amperometric biosensor for measuring protein tyrosine kinase activity.
本文报道了一种简单、低成本、可重复且无标记的蛋白酪氨酸激酶活性检测方法，基于酪氨酸酶构建安培生物传感器。该方法利用磷酸化可阻断酪氨酸酶催化氧化肽中酪氨酸或酪氨酸残基的特性：当使用 p60c-src 特异性肽底物 p60c-src substrate I 时，可快速测定 p60c-src 蛋白酪氨酸激酶（Src）的活性。该传感器对 S...
Detection of focal adhesion kinase activation at membrane microdomains by fluorescence resonance energy transfer.
细胞黏附激酶（FAK）的正确亚细胞定位对细胞黏附、迁移和力学转导等过程至关重要，但其在不同膜微区中的活性调控机制仍不清楚。为在活细胞中可视化不同膜微区的 FAK 活性，作者开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的 FAK 生物传感器，并通过脂质修饰将其靶向至去垢剂抵抗膜（DRM）区域或非 DRM 区域。结果显示，在细胞黏附到细胞...
Simultaneous visualization of protumorigenic Src and MT1-MMP activities with fluorescence resonance energy transfer.
Src激酶和膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）在肿瘤侵袭与转移中均起关键作用，但二者在致癌性表皮生长因子（EGF）刺激下如何时空协调尚不清楚。本研究将两对光谱不同的荧光共振能量转移（FRET）对——CFP/YFP与mOrange2/mCherry——组合，在单个活细胞中同时可视化Src和MT1-MMP活性。作者先在体外和哺乳动物...
Visualization of Src activity at different compartments of the plasma membrane by FRET imaging.
Src 是非受体酪氨酸激酶，参与细胞迁移、增殖和存活等过程，其活性受亚细胞定位精细调控。质膜并非均一，富含胆固醇、鞘磷脂和饱和脂肪酸的脂筏可作为信号平台，但 Src 在脂筏与非脂筏区室的调控机制仍不清楚，且传统去垢剂提取脂筏存在争议。为在活细胞中实时可视化局部 Src 活性，作者将基于 FRET 的 Src 生物传感器与膜靶向标签偶...
Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.
基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器能够以高时空分辨率在活细胞中可视化信号事件，但其灵敏度有限，限制了广泛应用。本研究将增强型青色荧光蛋白（ECFP）与黄色荧光蛋白变体 YPet 配对，构建 ECFP/YPet FRET 对。该 FRET 对可显著提高多种信号分子生物传感器的灵敏度，包括酪氨酸激酶 Src、小 GTP...
The spatiotemporal pattern of Src activation at lipid rafts revealed by diffusion-corrected FRET imaging.
基于荧光共振能量转移（FRET）的遗传编码生物传感器已被广泛用于以高时空分辨率可视化活细胞中的分子活性，但生物传感器蛋白的快速扩散会阻碍真实分子激活图的精确重建。作者基于荧光漂白后恢复（FRAP）实验，发展了一种有限元（FE）方法，用于分析、模拟并扣除可移动生物传感器的扩散效应。该方法被应用于分析定位于不同亚细胞区室的 Src FR...