组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
甘油（glycerol）；样品基质：葡萄酒（wine，红葡萄酒/白葡萄酒）
检测原理
甘油在甘油激酶（GK）催化下与 ATP 反应生成甘油-3-磷酸和 ADP；肌酸激酶（CK）利用磷酸肌酸将 ADP 再磷酸化为 ATP 并生成肌酸；肌酸酶（CRE）将肌酸水解为肌氨酸，肌氨酸氧化酶（SAOX）氧化肌氨酸产生 H2O2；过氧化物酶（HRP）催化 H2O2 将亚铁氰化物氧化为铁氰化物。铁氰化物在 -50 mV 工作电位下于电极表面被还原为亚铁氰化物，产生与甘油浓度成正比的安培电流。低电位避免了葡萄酒中多酚等电活性物质的干扰，多酶级联与介质循环实现信号放大。
检测灵敏度
GPE: LOD: 1.96 μM；线性范围: 5–640 μM；灵敏度: 0.80 nA μM^-1；R^2 = 0.9982 (n=13)。纳米复合电极: LOD: 2.24 μM；线性范围: 5–566 μM；灵敏度: 0.81 nA μM^-1；R^2 = 0.9986 (n=12)。
效应效果
两种传感器响应时间均为 70 s。同一传感器测量 100 μM 甘油时，GPE 平均电流 54.08 nA（n=8，RSD=5.67%），纳米复合电极 64.44 nA（n=8，RSD=7.08%）；制备重现性 RSD 分别为 8.97% 和 9.52%。连续 90 次测量无灵敏度损失，室温储存 15 个月后保留 90% 初始灵敏度。乙醇、糖、有机酸及多酚在测试浓度下未引起超过检出限的干扰。葡萄酒稀释 10 倍后测定，结果与酶法-分光光度法相关良好，可作为酿酒过程甘油监测的替代方法。
传感器的构成
- 基底/参比电极：玻璃-环氧-层压基底（glass–epoxy–laminate substrate）与印刷 Ag/AgCl 参比电极，提供平面电化学测量平台
- 工作电极：金平面电极（GPE，直径 1.6 mm）或纳米复合工作电极（N-eicosane 与 MWCNTs 固化于导电表面层），作为电流换能器
- 纳米材料修饰层：多壁碳纳米管（MWCNTs，直径 60–100 nm，长 5–15 μm）与 N-eicosane 形成纳米复合层，作为金表面的低成本替代
- 识别/催化元件：甘油激酶（GK）、肌酸激酶（CK）、肌酸酶（CRE）、肌氨酸氧化酶（SAOX）和过氧化物酶（HRP）组成的多酶级联，催化甘油转化为 H2O2 并氧化介质
- 固定层：1%（w/w）壳聚糖（chitosan）双层“三明治”夹持酶，固定酶并提高储存稳定性
- 信号介质：亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]）作为人工电化学介质，被 HRP/H2O2 氧化为铁氰化物后在电极还原产生电流
- 电子供体/辅因子：ATP、磷酸肌酸（creatine phosphate）和 MgSO4·7H2O 在测量缓冲液中，支持激酶/肌酸激酶级联反应
中文摘要
本研究开发了一种基于金平面电极（GPE）或含多壁碳纳米管（MWCNTs）纳米复合电极的多酶安培生物传感器，用于测定葡萄酒中的甘油。传感器通过将甘油激酶（GK）、肌酸激酶（CK）、肌酸酶（CRE）、肌氨酸氧化酶（SAOX）和过氧化物酶（HRP）组成的新型多酶级联夹在壳聚糖层之间固定而成。测量缓冲液中含有三磷酸腺苷（ATP）、磷酸肌酸和人工电化学介质亚铁氰化物。在相对于 Ag/AgCl 参比电极 -50 mV 的工作电位下，电极上铁氰化物被还原产生与甘油浓度成正比的电流。两种传感器的线性范围分别为 5–640 μM 和 5–566 μM，检出限分别为 1.96 μM 和 2.24 μM，灵敏度分别为 0.80 nA μM^-1 和 0.81 nA μM^-1，响应时间均为 70 s。传感器具有良好操作稳定性，连续 90 次测量无灵敏度损失，室温储存 15 个月后仍保留 90% 初始灵敏度。葡萄酒样品测定结果与酶法-分光光度法相关良好。该多酶级联还可用于甘油三酯或其他激酶底物的测定。
英文摘要
Amperometric biosensors based on gold planar or nanocomposite electrode containing multiwalled carbon nanotubes for determination of glycerol were developed. The biosensors were constructed by immobilization of a novel multienzyme cascade consisting of glycerol kinase/creatine kinase/creatinase/sarcosine oxidase/peroxidase between a chitosan "sandwich." A measuring buffer contained adenosine 5'-triphosphate (ATP), creatine phosphate, and an artificial electrochemical mediator ferrocyanide. The currents proportional to glycerol concentration were measured at working potential of -50 mV against Ag/AgCl reference electrode. The biosensors showed linearity over the ranges of 5-640 μM and 5-566 μM with detection limits of 1.96 and 2.24 μM and sensitivities of 0.80 and 0.81 nA μM(-1), respectively. Both types of biosensors had a response time of 70s. The biosensors demonstrated satisfactory operational stability (no loss of sensitivity after 90 consecutive measurements) and excellent storage stability (90% of the initial sensitivity after 15 months of storage at room temperature). The results obtained from measurements of wines correlated well with those obtained with an enzymatic-spectrophotometric assay. The presented multienzyme cascade can be used also for determination of triglycerides or various kinase substrates when glycerol kinase is replaced by other kinases.