组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S. pneumoniae）；样品基质为 LB 肉汤、BHI 肉汤及磷酸盐缓冲液中的细菌悬液/培养液
检测原理
该方法以细菌代谢产生的过氧化氢（H2O2）为间接识别事件。对过氧化氢酶阳性菌（如大肠杆菌），先向体系加入 H2O2，细菌过氧化氢酶催化 H2O2 分解为水和氧气，使溶液中 H2O2 浓度下降；对过氧化氢酶阴性菌（如肺炎链球菌），细菌代谢直接生成 H2O2，使浓度升高。复合电极中的辣根过氧化物酶（HRP）在 0.00 V 下催化 H2O2 氧化二茂铁（ferrocene）为二茂铁离子，电子经石墨/特氟龙复合层传递至电极，产生安培电流。H2O2 浓度越高，电流越大；细菌浓度越高，H2O2 消耗或生成量越大，电流下降或上升越明显。尼龙膜允许 H2O2 扩散并阻挡细菌污染。
检测灵敏度
H2O2 未覆膜电极: 线性范围 1.2–11.2 μM H2O2, r = 0.998, slope 3.52 nA μM−1；H2O2 尼龙膜覆膜电极: 线性范围 2.4–22.4 μM H2O2, r = 0.9990, slope 3.37 nA μM−1；E. coli 直接法 LOD: 5.7 × 10^7 cfu/mL (5 min), 3.6 × 10^6 cfu/mL (10 min), r2 = 0.98 (5 min), r2 = 0.94 (10 min)；E. coli 间接法 LOD: 1.8 × 10^6 cfu/mL, r2 = 0.9455；S. pneumoniae: 2.5 × 10^5 cfu/mL (15 min), 2 × 10^3 cfu/mL (3 h)；摘要: ≈2 × 10^6 cfu/mL E. coli (10 min), ≈2 × 10^5 cfu/mL S. pneumoniae (15 min)
效应效果
在 0.00 V 安培测量下，复合电极受 LB 培养基干扰小，可区分大肠杆菌过氧化氢酶消耗 H2O2 的信号；未覆膜时 10^8 cfu/mL E. coli 响应 RSD 为 29.3%，覆盖 0.45 μm 尼龙膜后降至 3.1%，电极可重复使用性提高。方法无需预浓缩、预富集或破壁，10 min 检测约 2×10^6 cfu/mL E. coli，15 min 检测约 2×10^5 cfu/mL S. pneumoniae。相比传统微生物鉴定需数天至数周，该方法快速、简单、成本低，并可区分过氧化氢酶阳性与阴性菌，作者认为可结合选择性捕获或选择性培养基用于多种细菌的常规快速检测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：石墨（graphite, ultra F purity）作为导电基底与电子传导介质
- 绝缘/结构材料：特氟龙（Teflon powder）与石墨混合形成复合电极，提供机械支撑和稳定结构
- 催化识别元件：辣根过氧化物酶（HRP, EC 1.11.1.7）催化 H2O2 氧化二茂铁，产生安培信号
- 电子供体/介体：二茂铁（ferrocene）作为可逆电子供体，在 0.00 V 被 HRP/H2O2 氧化，降低过电位和干扰
- 防污膜：0.45 μm 尼龙膜（nylon membrane）覆盖电极表面，防止细菌/培养基污染，提高可重复使用性
- 固定件：橡胶 O 形圈（rubber o-ring）固定尼龙膜
中文摘要
本文报道了一种基于石墨–特氟龙–过氧化物酶–二茂铁复合电极快速检测复杂培养基中过氧化氢酶阳性和阴性细菌的方法。该方法通过监测细菌代谢过程中过氧化氢的消耗或生成来实现检测，分别以大肠杆菌和肺炎链球菌作为过氧化氢酶阳性和阴性模式菌。过氧化氢在 0.00 V 下进行安培测量。作者优化了工作液组成、孵育时间和过氧化氢浓度等实验条件，并在生物电极表面覆盖尼龙膜，以减少细菌培养基造成的电极污染，提高传感器可重复使用性。在优化条件下，该方法无需预浓缩或预富集，即可在 10 min 内检测约 2×10^6 cfu/mL 的大肠杆菌，在 15 min 内检测约 2×10^5 cfu/mL 的肺炎链球菌。结果表明，该复合过氧化物酶生物传感器可用于复杂微生物体系中细菌的快速、灵敏和可重复检测。
英文摘要
The rapid detection of catalase-positive and catalase-negative bacteria in complex culture media has been accomplished by monitoring of hydrogen peroxide consumption or generation with a graphite-Teflon-peroxidase-ferrocene composite electrode. Escherichia coli and Streptococcus pneumoniae have been used as model catalase-positive and catalase-negative bacteria, respectively. Hydrogen peroxide evolution was amperometrically measured at 0.00 V. Experimental conditions, including the working solution composition, the incubation time and the hydrogen peroxide concentration, were optimized. The reusability of the biosensor was improved by placing a nylon membrane on the bioelectrode surface to prevent fouling caused by the bacterial medium. The developed methodology allowed the detection of E. coli and S. pneumoniae at concentration levels of approximately 2x10(6) and 2x10(5) cfu/mL, in assays taking 10 and 15 min, respectively, without any pre-concentration step or pre-enrichment procedure.