组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
层流胶（laminarin）、层流寡糖（laminarioligosaccharides）；样品基质为磷酸盐缓冲液（pH 7.3，含 0.14 M NaCl 和 0.005% Tween20）
检测原理
CBM-DK 通过氨基偶联固定在 CM5 SPR 芯片表面，形成识别层。当含不同浓度层流胶或层流寡糖的缓冲液流过芯片时，β-葡聚糖与 CBM-DK 的 α、β、γ 重复区结合。结合事件使金膜表面附近质量与折射率发生变化，导致表面等离子共振角偏移，仪器以响应单位（RU）实时记录。层流寡糖较短，主要与 α 重复区发生单价结合，表观 Ka 约 10^4 M−1；层流胶较长，可同时结合单个 CBM-DK 的多个位点或多个固定化 CBM-DK，产生多价 avidity 效应，使表观 Ka 升至约 10^6 M−1。突变去除 Asp270 或 Trp273 会削弱结合，从而改变 RU 响应。
检测灵敏度
线性范围（Scatchard 拟合）: 0.625–40 μM（laminarin）；0.16–1.28 mM（laminaritetraose）；0.08–0.64 mM（laminarihexaose）
效应效果
SPR 与 ITC 结果一致，CBM-DK 对层流胶的结合强于层流寡糖约 2 个数量级。层流胶 SPR 表观 Ka 为 1.1×10^6 M−1（5–40 μM）和 8.0×10^6 M−1（0.625–5 μM），ITC Ka 为 1.32×10^6 M−1，n=0.12，提示约 8 个 CBM-DK 结合 1 个层流胶；层流四糖和层流六糖 Ka 分别为 1.5×10^4 和 2.8×10^4 M−1，n≈1。D270A 几乎无结合，D311A/D355A 对层流胶仍保持较高表观 Ka，W273S 结合下降，说明 α 重复区主导识别。作者认为该 CBM13 可将催化结构域定位到不溶性 β-葡聚糖表面，促进水解，且识别模式不同于 Streptomyces lividans 木聚糖酶 CBM13。
传感器的构成
- 换能器基底：Biacore 2000 SPR 芯片 CM5，提供表面等离子共振信号读出与固定化表面
- 固定化层：CM5 芯片表面羧甲基葡聚糖（carboxymethyl dextran）/氨基偶联层，通过氨基偶联共价固定 CBM-DK
- 识别元件：重组 CBM-DK（CBM13，含 His-tag），固定于芯片表面，识别 β-葡聚糖
- 缓冲/再生体系：10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.3，含 0.14 M NaCl、0.005% Tween20）及 10 mM 乙酸缓冲液（pH 4.0）用于结合与再生
中文摘要
本文在大肠杆菌中过表达来源于 Cellulosimicrobium cellulans 内切-1,3-β-葡聚糖酶催化结构域 C 端的碳水化合物结合模块 13（CBM13，CBM-DK），并利用表面等离子共振（SPR）生物传感器和等温滴定量热（ITC）分析其与 β-葡聚糖、层流胶（laminarin）及层流寡糖（laminarioligosaccharides）的相互作用。结果显示，CBM-DK 与层流胶的结合常数约为 10^6 M−1，与层流寡糖约为 10^4 M−1，提示 α、β、γ 三个重复区中的 2 或 3 个结合位点以协同方式参与层流胶结合，其结合 avidity 比单价结合亲和力高约 2 个数量级。对保守 Asp 残基的定点突变分析表明，α 重复区主要贡献 β-葡聚糖结合；α 重复区中预测暴露于溶剂的 Trp273 也参与结合。α 重复区以约 10^4 M−1 亲和力结合 β-葡聚糖，其他重复区进一步结合层流胶，从而提高整体结合 avidity。该识别模式不同于 Streptomyces lividans 木聚糖酶 CBM13。
英文摘要
A carbohydrate-binding module from family 13 (CBM13), appended to the catalytic domain of endo-1,3-β-glucanase from Cellulosimicrobium cellulans, was overexpressed in E. coli, and its interactions with β-glucans, laminarin and laminarioligosaccharides, were analyzed using surface plasmon resonance biosensor and isothermal titration calorimetry. The association constants for laminarin and laminarioligosaccharides were determined to be approximately 10(6) M(-1) and 10(4) M(-1), respectively, indicating that 2 or 3 binding sites in the α-, β-, and γ-repeats of CBM13 are involved in laminarin binding in a cooperative manner. The binding avidity is approximately 2-orders higher than the monovalent binding affinity. Mutational analysis of the conserved Asp residues in the respective repeats showed that the α-repeat primarily contributes to β-glucan binding. A Trp residue is predicted to be exposed to the solvent only in the α-repeat and would contribute to β-glucan binding. The α-repeat bound β-glucan with an affinity of approximately 10(4) M(-1), and the other repeats additionally bound laminarin, resulting in the increased binding avidity. This binding is unique compared to the recognition mode of another CBM13 from Streptomyces lividans xylanase.