A sensitive electrochemical biosensor for detection of DNA methyltransferase activity by combining DNA methylation-sensitive cleavage and terminal transferase-mediated extension.

电化学生物传感器

DNA甲基转移酶活性（DNA methyltransferase activity，以DNA腺嘌呤甲基转移酶Dam MTase为模型）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）；样品基质：缓冲液/酶反应液

金电极表面自组装3'-巯基发夹DNA探针S1，其5'-GATC-3'序列作为Dam MTase底物。Dam MTase在SAM存在下将甲基转移至腺嘌呤N6位，形成5'-GAmTC-3'；甲基化敏感限制性内切酶Dpn I识别并切割该序列，在电极表面产生带3'-OH末端的新引物。末端转移酶TdTase将生物素化dUTP（dUTP-biotin）特异性掺入3'-OH末端，降低非特异背景。链霉亲和素-碱性磷酸酶SA-ALP结合生物素，ALP催化电化学惰性1-萘磷酸（1-NP）转化为电活性酚。DPV检测酚氧化峰，Dam MTase活性越高，切割与延伸越多，生物素/ALP越多，氧化电流越大；加入抑制剂则电流下降。酶促催化1-NP转化实现信号放大。

LOD: 0.04 U mL−1；线性范围: 0.1–20 U mL−1（对数线性）

该传感器在Dam MTase存在时产生强DPV氧化峰，无酶或不含特异识别序列的控制探针仅有很小或不显著氧化峰，表明识别序列依赖性和选择性。加入600 μM 5-氟尿嘧啶后氧化峰显著降低，说明可检测Dam MTase抑制剂并用于抑制剂筛选。作者指出该方法无需复杂仪器，Dam MTase检出限达0.04 U/mL，低于多数已报道方法，并克服了抑制剂对甲基化敏感限制性内切酶活性的影响，具有DNA MTase活性定量和抑制剂筛选应用潜力。原文未报告RSD、稳定性或实际样品回收率。

本文报道一种新型电化学生物传感器，用于DNA甲基转移酶（MTase）活性及其抑制剂检测。该传感器基于甲基化敏感切割激活引物，随后由末端转移酶（TdTase）介导生物素化dUTP延伸，并通过酶促放大实现敏感检测。以DNA腺嘌呤甲基转移酶（Dam MTase）为模型，3'-巯基发夹DNA探针自组装于金电极表面作为底物；Dam MTase将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基转移至特定序列腺嘌呤，形成甲基化序列，被Dpn I切割产生带3'-OH末端的新引物；TdTase将dUTP-biotin掺入引物末端，链霉亲和素-碱性磷酸酶（SA-ALP）结合生物素，ALP催化1-萘磷酸（1-NP）生成电活性酚，差分脉冲伏安法（DPV）读出。该法无需复杂仪器，Dam MTase检出限为0.04 U/mL，线性范围为0.1–20 U/mL，并可筛选5-氟尿嘧啶等抑制剂。