组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
金黄色葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxin type A, SEA）；样品基质：奶酪（Coalho cheese）及PBS标准溶液
检测原理
金电极表面先形成半胱胺自组装单分子层，再经EDC/NHS将蛋白A共价固定，使抗SEA抗体通过Fc段定向固定，Fab段暴露于溶液。样品中的SEA与固定抗体特异性结合后，加入HRP标记抗SEA抗体形成夹心复合物。随后加入H2O2和对苯二酚，HRP催化对苯二酚氧化为对苯醌，对苯醌在−35 mV金电极表面被还原，产生法拉第电流。SEA浓度越高，界面HRP越多，氧化还原循环产生的电流越大。对苯二酚作为电子媒介降低工作电位，减少干扰并保护生物分子。
检测灵敏度
LOD: 33.9 ng mL−1；LOQ: 112 ng mL−1；线性范围: 0.016–0.150 mg mL−1；r = 0.99
效应效果
该传感器对SEB、SEC、SED存在交叉反应，表2分别为28.6%、7.2%和30.5%，说明对SEA有一定选择性但受同家族毒素干扰。稳定性方面，EDC/NHS固定界面经50次循环伏安后变异系数为0.33%；三个电极在1 mg mL−1 SEA下重现性RSD为8.3%。实际奶酪样品先经Oxoid SET-RPLA试剂盒定性，再用本传感器检测，可区分污染与未污染样品，并在样品孵育后约1 h内获得定量结果。作者认为其适合用于奶酪等乳制品中SEA的快速食品安全检测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），经氧化铝抛光、超声、piranha溶液和电化学清洗，作为工作电极。
- 自组装单分子层：半胱胺（cysteamine，HS-CH2-CH2-NH2，10 mM）通过Au-S键自组装在金表面，提供氨基反应位点。
- 蛋白A固定层：金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A，5 mg mL−1）经EDC/NHS活化与半胱胺氨基共价结合，用于定向捕获IgG的Fc段。
- 识别元件：抗SEA多克隆抗体（anti-SEA antibody，100 mg mL−1）通过Fc段与蛋白A结合，Fab段朝向表面识别SEA。
- 封闭剂：1% BSA封闭非特异性结合位点，降低背景。
- 信号标记物：HRP标记抗SEA抗体（HRP-labeled anti-SEA antibody，约30 μg mL−1）与SEA形成夹心复合物。
- 底物/电子供体：H2O2（100 μM）和对苯二酚（hydroquinone，60 μM）作为HRP催化底物和电子媒介，在电极表面产生可测电流。
- 参比/对电极：Ag/AgCl参比电极和螺旋铂丝对电极，构成三电极电化学检测体系。
中文摘要
本文报道了一种基于自组装单分子层（SAM）和蛋白A在金电极上固定，用于灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）的新型电化学免疫传感器。测试了三种蛋白A固定方法：物理吸附、戊二醛交联以及经N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）/N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化后在半胱胺修饰金电极上的共价结合。选择EDC/NHS方法用于传感器开发。表面修饰步骤用循环伏安法表征，传感器响应用计时安培法测定。该免疫传感器的优势体现在高灵敏度和高特异性。所提出的安培免疫传感器成功用于污染和未污染奶酪样品中SEA的测定，响应良好。
英文摘要
This paper reports a novel electrochemical immunosensor for the sensitive detection of staphylococcal enterotoxin A (SEA) based on self-assembly monolayer (SAM) and protein A immobilization on gold electrode. Three different methods of protein A immobilization were tested: physical adsorption, cross-linking using glutaraldehyde and covalent binding after activation with N-hydroxysuccinimide (NHS)/N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) on cysteamine-modified gold electrode. The EDC/NHS method for protein A immobilization was selected to lead development of the biosensor. The coating steps of the surface modification were characterized by cyclic voltammetry and the biosensor response by chronoamperometry. The advantages of the immunosensor were exposed in its high sensitivity and specificity. The proposed amperometric immunosensor was successfully used for determination of SEA in contaminated and non-contaminated cheese samples with excellent responses.