组成图示
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传感器类型
其他（Octet生物层干涉仪）
检测对象
受体胞外域-Fc融合蛋白（receptor ECD-Fc fusion）、化学因子（chemokine）；样品基质：纯化蛋白溶液（MES/PBS缓冲液）
检测原理
Octet生物层干涉（BLI）法采用无标记检测。先将氨基反应性探针浸入MES pH 4.0缓冲液，再用EDC/NHS活化表面，使Fab1通过共价键固定于探针；随后用100 mM乙醇胺淬灭剩余活化位点。加入抗原receptor ECD-Fc后，抗原与固定Fab1结合，探针质量增加。再加入待测Fab2：若Fab2识别与Fab1不同或分离的表位，则Fab2可结合已捕获的抗原，使探针质量进一步增加；若识别相同或重叠表位，则Fab2不能结合，质量变化很小。BLI通过干涉信号将界面质量变化转换为传感器图，从而判断表位竞争关系，并用于筛选亲和力成熟克隆。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
作者报告pIX展示Fab库筛选结果与其他体外方法相当，可直接感染大肠杆菌回收噬菌体，省去化学解离；部分证据提示pIX亲和力筛选可能优于pIII。ELISA用于初筛与排序，Octet用于无标记表位分箱。对受体ECD-Fc筛得67个独特Fab，排序后保留46个，识别2个表位组；构建11个约10^8克隆的成熟库，高严格度筛选获得88个改进克隆（表位组1为60个、组2为28个），并回收27个原始VH序列。亲本亲和力1–100 nM，成熟克隆达40–400 pM（摘要称10–500 pM）。作者认为该方法可保持表位与序列多样性，利于获得可开发治疗性抗体。
传感器的构成
- 基底/换能器：amine-reactive sensor tip（Octet/ForteBio氨基反应性探针，用于固定Fab并通过生物层干涉检测质量变化）
- 活化/修饰层：EDC/NHS（1:50溶于MES pH 4.0，活化探针表面以共价捕获Fab）
- 封闭/淬灭层：100 mM ethanolamine（乙醇胺，淬灭未反应活化位点）
- 识别元件：Fab1（高亲和力Fab抗体片段，固定于探针表面并捕获抗原）
- 目标结合层：receptor ECD-Fc fusion（受体胞外域-Fc融合蛋白，作为抗原靶标）
- 竞争识别元件：Fab2（待测Fab抗体片段，用于检测与Fab1的表位竞争）
- 信号读出：Octet BLI mass change（无标记质量变化，Fab2结合导致探针质量增加）
中文摘要
过去二十年间，M13噬菌体展示用于抗体发现与优化已显著发展。抗体展示与筛选方法包括直接展示于pIII，或通过二硫键及卷曲螺旋适配蛋白间接展示。本文描述将Fab库展示于病毒颗粒另一端较小的pIX蛋白，并将其应用于从天然库中发现新型抗体。基于pIX介导展示的抗体筛选结果与其他体外方法相当，并可通过抗原结合噬菌体直接感染大肠杆菌高效回收，省去化学解离步骤；部分证据表明pIX展示在亲和力筛选中可能比pIII更高效。噬菌体来源抗体的功能评估常受亲和力不足或表位多样性缺乏限制。本文提出将Fab噬菌体库初筛命中克隆按表位分箱，并对克隆进行高通量成熟，以获得表位和序列多样的高亲和力结合体。采用Octet生物传感器以简便无标记方式检测Fab结合并确定表位竞争组。对一种受体胞外域和一种化学因子应用该分箱与亲和力成熟方法，亲本克隆亲和力由1–100 nM提高至10–500 pM。
英文摘要
Antibody discovery and optimization by M13 phage display have evolved significantly over the past twenty years. Multiple methods of antibody display and selection have been developed - direct display on pIII or indirect display through a Cysteine disulfide linkage or a coiled-coil adapter protein. Here we describe display of Fab libraries on the smaller pIX protein at the opposite end of the virion and its application to discovery of novel antibodies from naive libraries. Antibody selection based on pIX-mediated display produces results comparable to other in vitro methods and uses an efficient direct infection of antigen-bound phages, eliminating any chemical dissociation step(s). Additionally, some evidence suggests that pIX-mediated display can be more efficient than pIII-mediated display in affinity selections. Functional assessment of phage-derived antibodies can be hindered by insufficient affinities or lack of epitopic diversity. Here we describe an approach to managing primary hits from our Fab phage libraries into epitope bins and subsequent high-throughput maturation of clones to isolate epitope- and sequence-diverse panels of high affinity binders. Use of the Octet biosensor was done to examine Fab binding in a facile label-free method and determine epitope competition groups. A receptor extracellular domain and chemokine were subjected to this method of binning and affinity maturation. Parental clones demonstrated improvement in affinity from 1-100nM to 10-500pM.