组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
m1毒蕈碱受体激动剂（carbachol/Cch、acetylcholine/ACh及部分激动剂 oxotremorine、pilocarpine 等），样品基质：活细胞（HeLa、HEK293T、Sf9、Gq-/-G11-/-成纤维细胞）、分离膜、磷脂囊泡
检测原理
毒蕈碱激动剂（Cch/ACh）结合 m1 AChR 正构位点后，受体跨膜螺旋 5/6 胞内端及 i3 环发生构象重排，使 C 端 cp173Cer 供体与 i3 环 FlAsH 受体之间的距离和取向改变。FlAsH 通过四半胱氨酸 TC motif 选择性共价标记，增强荧光并固定受体取向。构象变化降低 FRET 效率，导致受体/供体发射比 Emi530/Emi475 下降约 15%–20%。信号随激动剂浓度呈 Hill 型依赖，细胞 FRET 响应 EC50 约 2.9 mM。Gαq 结合可提高受体对激动剂的表观亲和力，GTPγS 使受体-Gq 解离并消除该调节；FRET 报告本身不依赖 Gq。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2；报告 FRET 响应 EC50 = 2.9 mM，Hill 系数 n = 0.97；激动剂驱动 FRET 降低 15%–20%
效应效果
M1S2 在完整细胞和分离膜中均可报告激动剂激活，FlAsH 标记后仍能诱导 Ca2+ 瞬变，说明保留 Gq/PLCβ 偶联。细胞中 FRET 变化约 15%，膜中 FRET 与 [3H]QNB 竞争结合曲线一致，激动剂亲和力接近野生型 m1 受体；部分激动剂产生分级响应。阿托品可阻断 Cch 诱导的 FRET 变化。重构磷脂囊泡中，Gαqβ1γ2 使 Cch 亲和力增强近 100 倍，GTPγS 消除该增强。作者未报告 RSD、实际样品回收率或 ELISA/HPLC/qPCR 对比，但强调该传感器可实时测量 GPCR 激活动力学，并适用于其他 I 类 GPCR 药物靶点。
传感器的构成
- 膜环境：磷脂囊泡（PE、PC、胆固醇半琥珀酸酯）或细胞膜，承载 m1 AChR 并维持膜蛋白构象
- 受体骨架/识别元件：人源 m1 毒蕈碱乙酰胆碱受体（m1 AChR）核心受体，含 N 端 HA 信号序列、FLAG 表位、C 端 His6 标签和 i3 环缺失，负责结合毒蕈碱激动剂并偶联 Gq
- 激动剂结合位点：m1 AChR 正构结合位点，识别 carbachol（Cch）、acetylcholine（ACh）等毒蕈碱激动剂
- 供体荧光蛋白：循环置换 cerulean CFP 突变体 cp173Cer（A206K 单体化）融合于 C 端 V452 后，作为 FRET 供体，发射约 475 nm
- 受体标记位点：i3 环 P231 与 K359 之间插入四半胱氨酸 TC motif（CCxxCC），以 SG 连接肽连接，作为 FlAsH 选择性共价标记位点
- 信号标记物：FlAsH（双砷荧光素）与 TC motif 共价结合，作为 FRET 受体，发射约 530 nm，激动剂结合后 FRET 降低
- 功能偶联元件：Gαqβ1γ2 异三聚体 G 蛋白，与传感器结合并提高激动剂亲和力，可被 GTPγS 解离
- 换能/读出：荧光分光光度计或荧光显微镜，激发 433/430 nm，检测 475/470 nm 与 530/535 nm 发射比（Emi530/Emi475）
中文摘要
本文报道了一种用于测量 m1 毒蕈碱胆碱能受体（m1 AChR）激动剂激活的荧光生物传感器的设计、构建与验证。m1 AChR 是典型的 I 类 Gq 偶联受体。该传感器采用通用 FRET 设计：以循环置换的 CFP 突变体为供体，以可特异性反应荧光素 FlAsH 为受体；当完全激动剂结合时，FRET 信号降低 15%–20%。重要的是，该传感器基本保留野生型催化 Gαq 激活的能力，且纯化和重构后的传感器显示 Gq 对激动剂亲和力的适当调节。作者结合 I 类 GPCR 已知结构，描述了在增强激动剂驱动 FRET 变化的同时维持与 Gαq 调控相互作用的策略。该方法应可推广至其他包含众多重要药物靶点的 I 类受体。
英文摘要
We describe the design, construction and validation of a fluorescence sensor to measure activation by agonist of the m1 muscarinic cholinergic receptor, a prototypical class I G(q)-coupled receptor. The sensor uses an established general design in which Förster resonance energy transfer (FRET) from a circularly permuted CFP mutant to FlAsH, a selectively reactive fluorescein, is decreased 15-20% upon binding of a full agonist. Notably, the sensor displays essentially wild-type capacity to catalyze activation of Gα(q), and the purified and reconstituted sensor displays appropriate regulation of affinity for agonists by G(q). We describe the strategies used to increase the agonist-driven change in FRET while simultaneously maintaining regulatory interactions with Gα(q), in the context of the known structures of Class I G protein-coupled receptors. The approach should be generally applicable to other Class I receptors which include numerous important drug targets.