组成图示
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传感器类型
纳米孔生物传感器
检测对象
血栓结合适配体 G-四联体（TBA G-quadruplex）、线性血栓结合适配体（linear TBA）；样品基质：1 M 阳离子盐溶液（LiCl、NaCl、KCl、NH4Cl、CsCl、MgCl2、CaCl2、BaCl2，10 mM Tris，pH 7.2）
检测原理
αHL 纳米孔嵌入磷脂双分子层，cis/trans 腔充满 1 M 阳离子盐溶液。跨膜正电压驱动带负电 TBA 从 cis 向 trans 转位。线性 TBA 快速穿过孔道，产生短阻断；当 TBA 在阳离子作用下折叠为 G-四联体时，其尺寸与 αHL cap 域 nanocavity 匹配，被非共价捕获并部分阻断离子通道，产生长阻断。长阻断持续时间代表 G-四联体在孔内的寿命，末端短尖峰对应捕获的 G-四联体解折叠为线性 TBA 并快速转位。通过比较 TBA 与对照 Ctrl-2 的短阻断频率估算线性 TBA 浓度，进而计算平衡常数 Kf；由长阻断持续时间得解折叠速率 ku=1/τ，再由 Kf=kf/ku 得折叠速率 kf。阳离子种类改变 G-四联体稳定性、体积和折叠/解折叠动力学，使阻断幅度、持续时间和事件频率发生特征变化。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法为非共价、无标记单分子纳米孔检测，可区分 TBA G-四联体与线性形式。阳离子选择性为 K+ > NH4+ ~ Ba2+ > Cs+ ~ Na+ > Li+，Mg2+、Ca2+ 未诱导 G-四联体。长阻断持续时间随阳离子变化近 50 倍：Na+ 0.35 s、NH4+ 4 s、Cs+ 12 s、Li+/K+/Ba2+ 15–17 s。Kf 为 K+ 7.0、NH4+ 4.6、Ba2+ 4.2、Cs+ 2.8、Na+ 2.3、Li+ 1.5；K+-TBA ΔG0 -1.1 kcal/mol，与 SPR/FRET 一致。阻断百分比 Ba2+ 34% 至 Li+ 50%，反映体积变化。kf：Na+ 6.5 s-1 最快，Li+ 0.095 s-1 最慢；ku：Na+ 2.9 s-1 最快，Ba2+ 0.061 s-1 最慢。未报告 RSD/回收率。作者认为可用于其他四联体、蛋白–适配体相互作用及可调生物传感器设计。
传感器的构成
- 支撑基底：聚四氟乙烯薄膜（Teflon film），中央开 100–150 μm 孔，分隔 cis 与 trans 腔
- 脂质双分子层：1,2-diphytanoyl-sn-glycerophosphatidylcholine（DPhPC）形成平面磷脂双分子层，作为纳米孔嵌入基质
- 纳米孔/识别腔：α-溶血素（αHL）蛋白孔嵌入双分子层，其 cap 域形成约 4.6 nm 宽的 nanocavity，用于捕获单个 TBA G-四联体
- 识别/被测分子：血栓结合适配体（TBA，GGTTGGTGTGGTTGG），以 G-四联体或线性形式存在，阳离子调控其折叠状态
- 对照分子：Ctrl-2（GATTAGTGTGATTAG），不能形成 G-四联体，用于估算线性 TBA 浓度
- 电学换能/读出：cis/trans 1 M 阳离子盐溶液（10 mM Tris，pH 7.2）与跨膜电压驱动 DNA 转位，Axopatch 200A/200B 和 Digidata 1332 记录 pA 电流
中文摘要
富鸟嘌呤核酸可形成 G-四联体，在基因调控、生物传感器设计和纳米结构构建中具有重要作用。本文报道了一种基于纳米孔封装的单分子方法，用于研究阳离子如何调控血栓结合适配体（TBA，GGTTGGTGTGGTTGG）所形成 G-四联体的折叠与解折叠。纳米孔中的特征电流阻断表明，G-四联体形成具有阳离子选择性，选择性顺序为 K+ > NH4+ ~ Ba2+ > Cs+ ~ Na+ > Li+，且在 Mg2+ 和 Ca2+ 中未检测到 G-四联体。Ba2+ 可形成寿命较长的 G-四联体，但其能力受阳离子–DNA 相互作用影响。G-四联体的阳离子选择性形成与其体积相关，而体积随阳离子种类变化。K+ 诱导 G-四联体的高形成能力主要源于较慢的解折叠反应。尽管 Na+ 和 Li+ 四联体具有相似的平衡性质，但二者经历截然不同的动力学路径：Na+ 四联体折叠和解折叠最快，Li+ 四联体两者均最慢。理解这些离子调控的寡核苷酸性质有助于构建精细调控的生物传感器和纳米结构。该方法还可用于研究其他四联体及蛋白–适配体相互作用。
英文摘要
Guanine-rich nucleic acids can form G-quadruplexes that are important in gene regulation, biosensor design and nano-structure construction. In this article, we report on the development of a nanopore encapsulating single-molecule method for exploring how cations regulate the folding and unfolding of the G-quadruplex formed by the thrombin-binding aptamer (TBA, GGTTGGTGTGGTTGG). The signature blocks in the nanopore revealed that the G-quadruplex formation is cation-selective. The selectivity sequence is K(+) > NH(4)(+) approximately Ba(2+) > Cs(+) approximately Na(+) > Li(+), and G-quadruplex was not detected in Mg(2+) and Ca(2+). Ba(2+) can form a long-lived G-quadruplex with TBA. However, the capability is affected by the cation-DNA interaction. The cation-selective formation of the G-quadruplex is correlated with the G-quadruplex volume, which varies with cation species. The high formation capability of the K(+)-induced G-quadruplex is contributed largely by the slow unfolding reaction. Although the Na(+)- and Li(+)-quadruplexes feature similar equilibrium properties, they undergo radically different pathways. The Na(+)-quadruplex folds and unfolds most rapidly, while the Li(+)-quadruplex performs both reactions at the slowest rates. Understanding these ion-regulated properties of oligonucleotides is beneficial for constructing fine-tuned biosensors and nano-structures. The methodology in this work can be used for studying other quadruplexes and protein-aptamer interactions.