组成图示
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传感器类型
压电(QCM)生物传感器
检测对象
磷酸化乙酰胆碱酯酶（phosphorylated acetylcholinesterase, Phospho-AChE）；人血浆（human plasma）
检测原理
有机磷与乙酰胆碱酯酶（AChE）共价结合形成稳定的磷酸化加合物Phospho-AChE。在pH 4.0条件下，电沉积于ME修饰金电极上的ZrO2纳米薄膜呈Lewis酸性，其表面Zr原子可与Phospho-AChE的磷酸基团强结合，从而选择性捕获目标蛋白。随后HRP-anti-AChE与捕获的Phospho-AChE特异性结合。加入CN-H2O2后，HRP催化H2O2氧化CN，生成不溶性红紫色沉淀并持续沉积在晶体表面。根据Sauerbrey方程，沉淀质量增加使QCM共振频率下降，Δf随Phospho-AChE浓度增大而增大；酶催化沉淀实现质量放大，同时颜色变化提供快速定性读出。
检测灵敏度
LOD: 0.020 nM；线性范围: 0.025–10 nM
效应效果
该传感器对Phospho-AChE具有较高选择性：0.5 nM AChE与Phospho-AChE在ZrO2膜上的初始吸附Δf分别约为102±13 Hz和220±18 Hz，经洗涤后AChE大部分被去除，而Phospho-AChE保留；BSA（10 mg/mL）、AChE（0.1 nM）与Phospho-AChE（0.1 nM）的最终酶催化沉淀Δf差异明显。再生晶体对0.5 nM Phospho-AChE重复5次测量，RSD为17.6%。人血浆中AChE本底约8.0 ng/mL（≈0.12 nM），方法仍可用于低水平OP暴露生物监测。作者认为该EQCM免疫传感格式简单、实时、灵敏且适合现场应用，可作为神经毒剂/农药暴露现场生物监测的替代工具。
传感器的构成
- 基底/换能器：9 MHz 石英晶体微天平（QCM）金电极，提供压电换能与电沉积基底
- 模板修饰层：2-巯基乙醇（ME）羟基衍生单分子层，修饰金电极并引导ZrO2均匀电沉积
- 纳米捕获层：氧化锆（ZrO2）纳米颗粒/薄膜，由ZrOCl2电沉积形成，选择性吸附磷酸基团并负载沉淀
- 识别元件：辣根过氧化物酶（HRP）标记抗乙酰胆碱酯酶抗体（HRP-anti-AChE），识别捕获的Phospho-AChE
- 封闭层：BSA-PEG封闭缓冲液（3.0% BSA、1.0% PEG），封闭非特异性结合位点
- 反应底物：4-氯-1-萘酚（CN）与H2O2混合液，HRP催化生成不溶性沉淀
- 信号读出：EQCM频率变化（Δf）与红紫色视觉变化，分别用于定量和快速定性
中文摘要
本文报道了一种基于氧化锆（ZrO2）选择性吸附的电化学石英晶体微天平（EQCM）免疫分析方法，用于检测磷酸化乙酰胆碱酯酶（Phospho-AChE），作为有机磷（OP）农药和化学战剂暴露的生物标志物。首先，在石英晶体金电极表面构建羟基衍生单分子层，作为模板引导电沉积形成具有均匀纳米结构的ZrO2薄膜。该ZrO2膜可从样品基质中特异性捕获Phospho-AChE；随后，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗AChE抗体识别已捕获的磷酸化蛋白。加入4-氯-1-萘酚（CN）和H2O2后，HRP催化氧化CN生成不溶性沉淀并沉积在晶体表面。由此可通过质量放大的EQCM频率变化实现超灵敏定量，并通过产物红紫色变化实现快速定性。实验表明，该方法可在人血浆中检测Phospho-AChE，检出限为0.020 nM，为开发简单、灵敏且适用于现场的OP暴露生物监测传感器提供了新途径。
英文摘要
A zirconia (ZrO(2)) adsorption-based immunoassay by electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM) has been initially developed, aiming at the detection of phosphorylated acetylcholinesterase (Phospho-AChE) as a potential biomarker for bio-monitoring exposures to organophosphate (OP) pesticides and chemical warfare agents. Hydroxyl-derivatized monolayer was preferably chosen to modify the crystal serving as the template for directing the electro-deposition of ZrO(2) film with uniform nanostructures. The resulting ZrO(2) film was utilized to selectively capture Phospho-AChE from the sample media. Horseradish peroxidase (HRP)-labeled anti-AChE antibodies were further employed to recognize the captured phosphorylated proteins. Enzyme-catalytic oxidation of the benzidine substrate resulted in the accumulation of insoluble product on the functionalized crystal. Ultrasensitive EQCM quantification by mass-amplified frequency responses as well as rapid qualification by visual color changes of product could be thus, achieved. Moreover, 4-chloro-1-naphthol (CN) was studied as an ideal chromogenic substrate for the enzyme-catalytic precipitation. Experimental results show that the developed EQCM technique can allow for the detection of Phospho-AChE in human plasma with a detection limit of 0.020 nM. Such an EQCM immunosensing format opens a new door towards the development of simple, sensitive, and field-applicable biosensor for biologically monitoring low-level OP exposures.