组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
番茄花叶小矮病毒复制蛋白 p33（TBSV p33）、p92（TBSV p92）及其截短/突变体蛋白；样品基质为重组蛋白溶液（HBS-EP运行缓冲液）
检测原理
SPR检测基于光在金属表面激发表面等离子体时，界面折射率变化引起共振角/共振单位变化。实验将MBP-p33C通过EDC/NHS共价固定于CM-5芯片Fc1，Fc2固定MBP作为参考。当含p33C、p92或其突变体的蛋白溶液流过芯片时，分析物与固定蛋白结合，使界面质量增加，局部折射率升高，产生正向共振单位响应；停止注射后结合物解离，信号下降。参考表面响应用于扣除非特异结合和缓冲液体积效应。通过25–500 nM多浓度注射获得结合/解离曲线，并用BIAevaluation按1:1模型拟合得到kon、koff和KD。该方法无需标记，直接以质量响应反映结合事件。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法利用MBP参考表面扣除非特异结合与缓冲液体积效应，提高结合信号选择性；pH scouting显示pH 4.5和5.0时MBP-p33C预浓缩最高，最终选择pH 5.0进行固定。定性结合分析固定约8000 RU，动力学分析固定约250 RU，CM-5芯片可重复使用约100次。p33C自相互作用数据按1:1模型拟合良好，得到Kon 2.11×10^4 M^-1 s^-1、Koff 4.74×10^-3 s^-1、KD 2.25×10^-7 M。原文未报告RSD、实际样品回收率或与ELISA/HPLC/qPCR的对比。作者主张该SPR方法可用于TBSV复制蛋白相互作用研究，为病毒复制控制靶点识别提供依据。
传感器的构成
- 基底/换能器：BIAcore CM-5传感器芯片，表面为羧甲基葡聚糖基质，承载SPR光学信号。
- 活化修饰层：EDC/NHS（1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide / N-hydroxysuccinimide），活化羧基形成活性酯。
- 识别元件：MBP-p33C（TBSV p33 C端MBP融合蛋白）固定于Fc1，用于捕获/识别p33、p92蛋白。
- 参考元件：MBP固定于Fc2，作为非结合参考表面扣除非特异结合与体积效应。
- 封闭剂：ethanolamine-HCl，灭活未反应活性酯。
- 再生/清洗液：50 mM NaOH，去除结合蛋白并恢复芯片表面。
- 运行缓冲液：HBS-EP（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween-20），维持蛋白稳定并输送分析物。
- 信号读出：BIAcore X SPR仪器与BIAevaluation 4.1，输出共振单位（RU）传感图。
中文摘要
病毒RNA基因组由病毒复制酶进行复制，是病毒感染周期的核心过程。多数RNA病毒编码一个或多个自身基因组翻译蛋白，用于组装病毒复制酶复合体，该复合体包含病毒RNA、病毒蛋白以及被劫持的宿主蛋白，并嵌入细胞膜中。理解复制蛋白的多种生化活性有助于识别干预靶点，以控制病毒感染或减轻宿主细胞损伤。本文以番茄花叶小矮病毒（TBSV）复制蛋白为模型体系，采用表面等离子共振（SPR）分析研究病毒复制蛋白之间的相互作用动力学。SPR检测通过测量传感器芯片表面因固定蛋白与流过蛋白发生相互作用引起质量变化而导致的折射率变化，从而提供实时蛋白相互作用数据。研究使用BIAcore X SPR生物传感器开展TBSV复制蛋白相互作用分析，并采用BIAevaluation软件进行动力学数据拟合。
英文摘要
Replication of the viral RNA genome performed by the viral replicase is the central process during the viral infection cycle (Nagy and Pogany, see earlier chapter four). Most RNA viruses assign one or more proteins translated from their own genomes for assembling the viral replicase complex, which consists of the viral RNA, viral proteins, and several subverted host proteins embedded in cellular membranes. Understanding the various biochemical activities of the replication proteins can lead to target identification for human intervention to control viral infections or the damage to the host cells. The replicase proteins of tomato bushy stunt virus (TBSV) are selected as model system to study the dynamics of interactions between viral replicase proteins using surface plasmon resonance (SPR) analysis. The SPR assay provides real-time protein interaction data by measuring the change in refractive index at the surface of the sensor chip due to the change in mass resulting from the interaction between the immobilized protein and the protein that is being passed over the immobilized chip surface. SPR-based biosensor BIAcore X was used to carry out TBSV replicase protein interaction studies.