组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞内钙离子（intracellular Ca2+，[Ca2+]）、MLCK 激活（MLCK activation，以 Ca2+-CaM 结合/FRET 比值反映）；样品基质：完整小鼠肠系膜小动脉平滑肌细胞（intact mouse mesenteric small artery smooth muscle cells）。另同步记录动脉收缩力（arterial force）作为力学输出。
检测原理
在完整肠系膜小动脉中，KCl 等刺激使平滑肌细胞内 Ca2+ 升高。fura-2 与 Ca2+ 结合后，其 340/380 nm 激发荧光比值随 [Ca2+] 变化，经 480/40 nm 发射采集。转基因表达的 MLCK FRET 传感器由 CFP 与 YFP 组成；Ca2+ 结合钙调蛋白形成 Ca2+-CaM 后与 MLCK 传感器结合，引起构象变化并改变 CFP-YFP 能量转移效率，使 CFP/YFP 比值反映 MLCK 激活状态。系统以 340、380、440 nm 顺序激发，分别选择性读取 fura-2 与 CFP/YFP，并对 CFP 串扰进行校正。动脉收缩力由线式肌图仪同步记录，从而将识别事件、光学 FRET/荧光信号与力学输出关联。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
选择性良好：440 nm 激发 fura-2 发射仅为 380 nm 的 4.4%，380 nm 激发 CFP 仅为 440 nm 的 5.0%；YFP 通道含约 50% CFP 串扰，校正后基线略移，但不显著改变比值幅度与时间过程。KCl 下力、MLCK FRET 与 Ca2+ 信号可维持近 30 min。Y-27632（1.0 μM）使初始瞬时力降至对照的 77.6±5.4%、稳态力降至 49.9±4.8%，对 MLCK FRET 和 Ca2+ 无显著影响。forskolin（10.0 μM）使 MLCK FRET 降至 KCl 变化的 61.3±5.6%，力先降至 73.9±2.7%，结束时降至 7.8±3.4%。该技术可观察完整小动脉中 MLCK 激活与钙敏感性。
传感器的构成
- 基底/生理换能器：完整小鼠肠系膜小动脉（intact mouse mesenteric small artery），固定于线式肌图仪，提供平滑肌收缩力与胞内环境
- 识别元件：转基因表达的 MLCK FRET 生物传感器（CFP-YFP 融合蛋白），通过 CFP-YFP FRET 变化报告 Ca2+-CaM 结合与 MLCK 激活
- 钙指示剂：fura-2 AM（负载后为 fura-2），以 340/380 nm 激发、480/40 nm 发射报告胞内 Ca2+
- 光学激发/分束：Lambda DG-4 高速波长切换光源（175 W 氙灯）、Nikon 20× 物镜、Dual-View 滤光片组（505 nm 二向色镜、480/40 nm 与 535/35 nm 发射滤片）
- 荧光读出：XR/Mega-10 增强型 CCD 相机，采集 CFP/YFP 与 fura-2 荧光图像
- 力学读出：wire myograph（Danish Myotech Technology），记录动脉收缩力（mN）
中文摘要
Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器分子是揭示细胞内特定分子相互作用的重要工具，但通常用于培养细胞，而培养细胞与完整机体中的细胞在基因表达和生理刺激/输出测量方面存在差异。本研究利用表达 FRET 型肌球蛋白轻链激酶（MLCK）生物传感器分子的转基因小鼠，报道了一种在完整、功能小鼠小动脉平滑肌细胞中动态观察 MLCK 激活与调节的技术。该技术可同时测量动脉收缩力产生和胞内钙离子浓度（[Ca2+]）。通过宽场荧光成像，结合 fura-2 钙指示剂与 CFP-YFP 型 MLCK FRET 传感器，作者实现了在生理刺激下对 Ca2+、MLCK 激活和力学输出的近同步观测，为研究完整小动脉中钙-钙调蛋白-MLCK 信号与收缩力关系提供了方法。
英文摘要
FRET (Forster resonance energy transfer)-based biosensor molecules are powerful tools to reveal specific molecular interactions in cells. Typically however, they are used in cultured cells that (inevitably) express different genes than their counterparts in intact organisms. In such cells it may be impossible to administer physiological stimuli and measure physiological outputs. Here, through the use of transgenic mice that express a FRET-based myosin light chain kinase (MLCK) biosensor molecule, we report a technique for dynamically observing activation and regulation of MLCK within the smooth muscle cells of intact, functioning small arteries, together with measurement of arterial force production and intracellular [Ca(2+)].