组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Rab5 活性（Rab5 activity, Rab5-GTP）；样品基质：活细胞（Swiss3T3/integrin avb3、BAM3）吞噬凋亡胸腺细胞（apoptotic thymocytes）的质膜/吞噬体膜
检测原理
Raichu-Rab5 是比值型 FRET 探针：SECFP 为供体，Venus 为受体，中间由 EEA1 的 Rab5 结合域（RBD）连接 Rab5a。当 Rab5a 结合 GTP 时，RBD 与荧光蛋白的相对距离/取向改变，使 SECFP 到 Venus 的 FRET 增强；结合 GDP 时 FRET 降低。用 440 nm 激发，同时采集 475 nm CFP 和 525 nm YFP 发射，FRET/CFP 或 525/475 比值随局部 Rab5-GTP 水平升高而升高。Raichu-Rab5/PM 通过 Ki-Ras 羧基末端肽锚定质膜/吞噬体膜，减少胞质 RabGDI 结合探针造成的背景。该探针反映膜上 GEF 与 GAP 活性平衡，无外源酶促放大，依赖 FRET 比值型构象传感，可实时成像吞噬过程中 Rab5 激活的时空动态。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
探针表征显示，Rab5-Q79L 使 FRET 升高，Rab5-S34N 使 FRET 降低，GTP 装载与真实 Rab5 相关；Rabex-5、Rin1、Gapex-5 剂量依赖增强 FRET，RabGAP-5、RN-tre 剂量依赖降低 FRET。Raichu-Rab5 与早期内体标记 EEA1 FYVE、p40phox PX 共定位，不与 Rab7、Rab11a 重叠。Raichu-Rab5/PM 改善膜定量。吞噬实验中，Rab5 激活在肌动蛋白解聚后开始，平均 4 min 内达峰，37% 吞噬体再激活；0.1 mM nocodazole 抑制激活，10 nM paclitaxel 抑制重复激活；Gapex-5 或 EB1 缺失抑制激活，抗性 Gapex-5 可恢复。Rab5-S34N 延迟凋亡胸腺细胞 EGFP 荧光消失。作者认为该传感器可实时解析吞噬体成熟中 Rab5 调控。
传感器的构成
- 膜定位/锚定层：Ki-Ras 羧基末端肽（RKMSKDGKKKKKKSKTKCVIM），用于 Raichu-Rab5/PM 锚定质膜/吞噬体膜
- 探针融合层：Raichu-Rab5（SECFP-EEA1 RBD-Venus-Rab5a），作为基因编码 FRET 探针
- 识别元件：EEA1 氨基端 Rab5 结合域（RBD，氨基酸 36–218），结合 Rab5 并感知 GTP/GDP 状态
- 目标结合蛋白：Rab5a（小 GTPase），被 RBD 结合，其 GTP 结合状态改变探针构象
- 荧光供体：SECFP（改良 CFP），提供 475 nm 发射并作为 FRET 供体
- 荧光受体：Venus（改良 YFP），提供 525 nm 发射并作为 FRET 受体
- 信号读出：双发射 FRET 荧光成像系统（IX81 倒置显微镜、CCD、440 nm 激发、455 nm 二向色镜、480/535 nm 发射滤片），计算 FRET/CFP 比值
中文摘要
高效吞噬凋亡细胞对组织稳态和免疫应答至关重要。Rab5 是早期内吞途径关键调节因子，也参与凋亡细胞吞噬，但其时空动态尚不清楚。本研究开发基因编码 FRET 生物传感器 Raichu-Rab5，在活细胞中实时成像 Rab5 活性。探针由 Venus、EEA1 氨基端 Rab5 结合域、SECFP 和 Rab5 组成；Rab5-GTP 升高使 FRET 增强，可用 525/475 nm 发射比值表示。在 MFG-E8 介导的凋亡胸腺细胞吞噬中，吞噬体膜 Rab5 活性在肌动蛋白外套解聚后升高，可持续或反复激活长达 10 min，并在凋亡细胞崩解前结束。显性负突变 Rab5-S34N 延迟凋亡胸腺细胞崩解，表明 Rab5 参与吞噬体成熟。鬼臼碱破坏微管后，吞噬体膜 Rab5 激活受抑制，而吞噬过程不受影响。Gapex-5 是 Rab5 激活所必需的鸟苷酸交换因子，并与微管尖端蛋白 EB1 结合；EB1 缺失抑制 Rab5 激活。据此提出微管网络将 Gapex-5 招募至吞噬体并诱导瞬时 Rab5 激活的模型。
英文摘要
Efficient phagocytosis of apoptotic cells is crucial for tissue homeostasis and the immune response. Rab5 is known as a key regulator of the early endocytic pathway and we have recently shown that Rab5 is also implicated in apoptotic cell engulfment; however, the precise spatio-temporal dynamics of Rab5 activity remain unknown. Here, using a newly developed fluorescence resonance energy transfer biosensor, we describe a change in Rab5 activity during the engulfment of apoptotic thymocytes. Rab5 activity on phagosome membranes began to increase on disassembly of the actin coat encapsulating phagosomes. Rab5 activation was either continuous or repetitive for up to 10 min, but it ended before the collapse of engulfed apoptotic cells. Expression of a dominant-negative mutant of Rab5 delayed this collapse of apoptotic thymocytes, showing a role for Rab5 in phagosome maturation. Disruption of microtubules with nocodazole inhibited Rab5 activation on the phagosome membrane without perturbing the engulfment of apoptotic cells. Furthermore, we found that Gapex-5 is the guanine nucleotide exchange factor essential for Rab5 activation during the engulfment of apoptotic cells. Gapex-5 was bound to a microtubule-tip-associating protein, EB1, whose depletion inhibited Rab5 activation during phagocytosis. We therefore propose a mechanistic model in which the recruitment of Gapex-5 to phagosomes through the microtubule network induces the transient Rab5 activation.