组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
磺酰胺类碳酸酐酶II抑制剂（sulfonamide CAII inhibitors，如sulpiride、acetazolamide等）、片段库化合物（fragment library compounds）；样品基质：含1% DMSO的PBS缓冲液/化合物库DMSO溶液
检测原理
生物素化碳酸酐酶II（bCAII）通过生物素–链霉亲和素作用固定于AP-3000的SA-401传感器棒反应流室，可溶性生物素封闭剩余SA位点。磺酰胺类小分子分析物在PBS/1% DMSO中进样，与bCAII活性位点结合后，界面质量与折射率发生变化，SPR共振角随之改变，仪器以共振单位（RU）实时记录结合与解离曲线。AP-3000采用停流进样，流动阶段受对流传质控制，停流阶段转为扩散控制，因此响应曲线较恒流SPR复杂；动力学分析仅取流动段数据并全局拟合1:1模型（含传质项）提取ka、kd和KD。片段筛选中，对参考面扣除、基线归一化并用阳性对照sulpiride活性衰减校正，获得报告点响应用于命中筛选。
检测灵敏度
相关系数: 0.958（ka）、0.997（kd）、0.994（KD）
效应效果
AP-3000 的六个反应流室 bCAII 捕获量约 16,000 RU，流室间差异小于 3%，重复响应高度重叠，表明重现性好。SA-401 传感器棒对典型生物素化蛋白捕获量可达 18,000–22,000 RU，适合小分子检测。与 Biacore T100 相比，10 种磺酰胺抑制剂的 ka、kd 和 KD 相关系数分别为 0.958、0.997 和 0.994，说明停流进样下仍可提取可靠动力学。仪器可在 24 h 内检测 10 块 384 孔板，单根传感器棒约支持 5 块板；对约 3800 个化合物进行 100 µM 片段筛选，阳性对照 sulpiride 活性衰减可校正，获得约 100 个潜在命中，作者认为其适合高通量药物筛选。
传感器的构成
- SPR换能器：Fujifilm AP-3000 sensor stick，含12个流室，6个反应面与6个参考面，用于无标记光学检测
- 参考面：AP-3000 sensor stick 中6个参考流室，用于扣除背景折射率变化
- 固定化识别层：SA-401 链霉亲和素（SA）传感器棒，通过生物素–链霉亲和素作用捕获靶标
- 靶标识别元件：生物素化碳酸酐酶II（bCAII），作为结合磺酰胺类抑制剂的靶蛋白
- 封闭剂：可溶性生物素（biotin），封闭未结合SA位点
- 运行缓冲液：无Ca2+/Mg2+ PBS 加1% DMSO，维持蛋白活性并校正折射率
中文摘要
本文评估了富士胶片新型 AP-3000 表面等离子共振（SPR）生物传感器在动力学分析和片段筛选中的性能。作者以碳酸酐酶 II（CAII）为模型体系，表征了 10 种磺酰胺类小分子抑制剂，分子量 98–341 Da，亲和力约跨越 10000 倍（0.4 mM 至 20 nM）。虽然 AP-3000 所得数据总体与 Biacore T100 相似，但其停流式分析物进样系统使结合与解离响应曲线形状复杂化。作者说明，仅对流动条件下采集的数据区域进行拟合，即可从 AP-3000 数据中获得合理的动力学速率常数估计。此外，文章还给出了利用 AP-3000 进行片段筛选的示例，表明该技术是该类高通量筛选应用的理想平台。
英文摘要
We evaluated the performance of Fujifilm's new AP-3000 surface plasmon resonance biosensor for kinetic analysis and fragment screening. Using carbonic anhydrase II as a model system, we characterized a set of 10 sulfonamide-based inhibitors that range in molecular mass from 98 to 341Da and approximately 10,000-fold in affinity (0.4mM to 20nM). Although the data collected from the AP-3000 were generally similar to those collected using a Biacore T100, the AP-3000's stop-flow analyte delivery system complicated the shapes of the association- and dissociation-phase binding responses. We illustrate how reasonable estimates of the kinetic rate constants can be extracted from AP-3000 data by limiting data analysis to only the regions of the responses collected during flow conditions. We also provide an example of the results obtained for a fragment-screening study with the AP-3000, which is the ideal application of this technology.