组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）；膜表面电荷（surface charge）；样品基质：完整细胞（S. cerevisiae、RAW264.7巨噬细胞）的质膜细胞质侧及内体/溶酶体
检测原理
PS探针由乳粘附素C2域（Lact-C2）与GFP/mRFP融合构成。Lact-C2以钙非依赖方式特异性识别膜脂磷脂酰丝氨酸（PS）；当细胞质侧膜含PS时，探针从胞质转移到膜界面，荧光定位由弥散变为质膜/内体信号，PS缺陷或结合突变体则保留在胞质。表面电荷探针由法尼基链锚定膜，并携带2+至8+阳离子序列，通过静电作用与膜负电荷结合；正电荷越多，越富集于负电荷更强的膜。PS在内体/溶酶体细胞质侧富集，使这些膜呈中等负电荷，招募中等阳离子蛋白。钙内流引起质膜PS外翻和PIP2水解，质膜负电荷降低，强阳离子蛋白如K-Ras从质膜重定位到内体。该传感未使用酶促或核酸放大，直接以共聚焦荧光成像和Manders共定位读出。
检测灵敏度
原文未报告检出限（LOD）、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
探针选择性良好：Lact-C2可被含5%–20% PS脂质体竞争性置换，但不被PC、PE、PA、PI或PIP2置换；GFP-Lact-C2仅结合PS涂层珠。PS缺陷酵母中探针呈胞质分布，野生型酵母定位于质膜；RAW264.7巨噬细胞中同时标记质膜、早期内体、晚期内体和溶酶体。PIP2/PIP3耗竭、PI3P耗竭或降低膜负电荷均不改变Lact-C2定位，说明其依赖PS而非一般负电荷。电荷探针2+至8+随正电荷增加更多定位于质膜，6+与Lact-C2阳性内体共定位；ATP/磷脂酰肌醇耗竭后8+从质膜重定位到Lact-C2阳性内体，PS缺陷酵母中8+膜结合降低。作者主张PS通过膜表面电荷调控c-Src、Rac、K-Ras等阳离子蛋白定位。
传感器的构成
- 传感界面：细胞质侧膜脂双层（含磷脂酰丝氨酸PS或不同表面电荷），作为探针结合与定位的界面
- 识别元件：乳粘附素C2域（Lact-C2），特异性结合PS
- 荧光换能器：绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（mRFP），与Lact-C2融合提供荧光信号
- 阴性对照元件：GFP-Lact-C2-AAA突变体，破坏PS结合，用于验证特异性
- 电荷识别元件：法尼基链（farnesyl chain）与阳离子序列（2+至8+），锚定膜并感知表面负电荷
- 电荷荧光换能器：GFP/mRFP融合电荷探针，报告膜表面电荷依赖的蛋白定位
- 表达/样品系统：细菌表达纯化重组Lact-C2；酵母（S. cerevisiae）和RAW264.7巨噬细胞表达探针
中文摘要
带多碱性簇或阳离子结构域的蛋白可被负电荷膜通过静电作用靶向到特定亚细胞区室。磷脂酰丝氨酸（PS）是细胞膜中主要的阴离子磷脂，但其在完整细胞各膜表面电荷中的贡献长期未知，部分原因是缺乏可在完整细胞中分析其分布的试剂。作者开发了一种遗传编码荧光生物传感器，用于研究PS的亚细胞分布。该探针由乳粘附素C2结构域（Lact-C2）与绿色荧光蛋白（GFP）融合而成，可钙非依赖地特异性结合PS。结果显示，PS主要位于质膜细胞质侧，也分布于内体和溶酶体。PS所携带的负电荷将中等阳离子蛋白导向内吞途径；而通常定位于质膜的更强阳离子蛋白，在钙内流导致质膜表面电荷降低时，会重新定位到内吞区室。该工作揭示了PS通过调节膜表面电荷参与蛋白亚细胞靶向。
英文摘要
Electrostatic interactions with negatively charged membranes contribute to the subcellular targeting of proteins with polybasic clusters or cationic domains. Although the anionic phospholipid phosphatidylserine is comparatively abundant, its contribution to the surface charge of individual cellular membranes is unknown, partly because of the lack of reagents to analyze its distribution in intact cells. We developed a biosensor to study the subcellular distribution of phosphatidylserine and found that it binds the cytosolic leaflets of the plasma membrane, as well as endosomes and lysosomes. The negative charge associated with the presence of phosphatidylserine directed proteins with moderately positive charge to the endocytic pathway. More strongly cationic proteins, normally associated with the plasma membrane, relocalized to endocytic compartments when the plasma membrane surface charge decreased on calcium influx.