组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
胞内环磷酸腺苷（cAMP）、细胞氧化还原状态（redox status）；样品基质：C10 肺泡 II 型上皮细胞胞内环境（暴露 H2O2 或葡萄糖氧化酶）
检测原理
H2O2 或葡萄糖氧化酶产生的 H2O2 进入 C10 细胞后改变胞内氧化还原状态，并刺激腺苷酸环化酶/相关通路使 cAMP 升高。cAMP 结合 Epac1-camps 的 Epac1 识别域，引起 ECFP 与 EYFP 间距离或取向变化，降低 FRET 效率，使 485 nm/535 nm 发射比升高；cAMP 越高，比值变化越大。同时，roGFP2 的敏感半胱氨酸被氧化后改变激发光谱，400 nm/490 nm 激发比升高，反映氧化程度。荧光显微镜连续采集双发射或双激发比值，将分子识别事件转换为可定量荧光比值信号。该过程无酶催化沉积或核酸放大，主要依赖 FRET 与氧化还原敏感荧光蛋白的比值成像。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
研究在 C10 肺泡 II 型细胞中验证 H2O2（100–300 μM）和葡萄糖氧化酶（5、15、30 mU/ml）诱导 CREB 磷酸化，且可被 NAC 或 catalase 抑制。H89（10 μM）抑制 PKA 后，H2O2 诱导的 p-CREB 和 p-ERK1/2 降低；AG1478（10 μM）抑制 EGFR 后，p-CREB、p-ERK1/2 及 PKA 催化亚基核转位下降。siCREB 使 CREB mRNA 和蛋白敲降超过 80%，并降低 bcl-2 与 c-fos 转录，增加 GO 或 TNFa 诱导凋亡。作者据此主张 PKA–EGFR–ERK1/2–CREB 串扰是氧化应激下细胞存活通路。原文未报告 RSD、回收率或与 ELISA/HPLC/qPCR 的定量对比。
传感器的构成
- 成像基底：玻璃盖玻片，承载 C10 细胞并用于倒置荧光显微镜成像
- 报告分子：Epac1-camps FRET cAMP 生物传感器，由 ECFP 与 EYFP 组成，cAMP 结合引起 FRET 变化
- 识别元件：Epac1-camps 的 cAMP 结合域，特异性结合胞内 cAMP
- 氧化还原探针：roGFP2，氧化还原敏感 GFP，氧化状态改变 400/490 nm 激发比
- 信号读出：荧光显微镜双发射/双激发比成像，输出 485/535 nm 或 400/490 nm 比值
中文摘要
氧化应激参与肺纤维化和癌症等肺病发病。我们此前发现 H2O2 在 C10 肺泡 II 型细胞中启动 Ca2+/cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）磷酸化增加，需要 ERK1/2 激活。本研究考察 PKA 与 EGFR 串扰在氧化诱导 ERK1/2 和 CREB 信号中的作用。H2O2 增加 PKA 核积累，H89 抑制 PKA 降低氧化诱导的 CREB 和 ERK1/2 磷酸化。使用 FRET 型 cAMP 生物传感器和氧化还原敏感 GFP 进行单细胞 cAMP 与氧化还原状态测量，表明 H2O2 增加 cAMP 生成，且与氧化还原状态相关。抑制 EGFR 活性降低 H2O2 诱导的 CREB 磷酸化和 PKA 核转位，提示 PKA 与 EGFR 串扰是氧化诱导 CREB 反应基础。siRNA 敲降 CREB 表达导致 bcl-2 下降和氧化诱导凋亡增加。数据揭示 PKA、ERK1/2 和 CREB 串扰在氧化应激细胞存活中的新作用。
英文摘要
Oxidant stress plays a role in the pathogenesis of pulmonary diseases, including fibrotic lung disease and cancer. We previously found that hydrogen peroxide (H2O2) initiates an increase in Ca2+/cAMP-response element binding protein (CREB) phosphorylation in C10 alveolar type II cells that requires activation of extracellular regulated kinases 1/2 (ERK1/2). Here, we investigated the role of crosstalk between protein kinase A (PKA) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in oxidant-induced signaling to ERK1/2 and CREB in C10 cells. Application of H2O2 increased nuclear accumulation of PKA, and inhibition of PKA with H89 reduced oxidant-mediated phosphorylation of both CREB and ERK1/2. Single cell measurements of cAMP and redox status, using a FRET-based biosensor and a redox-sensitive GFP, respectively, indicated that H2O2 increases production of cAMP that correlates with redox state. Inhibition of EGFR activity decreased both H2O2-induced CREB phosphorylation and translocation of PKA to the nucleus, suggesting that crosstalk between PKA and EGFR underlies the oxidant-induced CREB response. Furthermore, knockdown of CREB expression using siRNA led to a decrease in bcl-2 and an increase in oxidant-induced apoptosis. Together these data reveal a novel role for crosstalk between PKA, ERK1/2 and CREB that mediates cell survival during oxidant stress.