组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
人补体因子 H（human factor H, FH）；样品基质：人血浆纯化后稀释于运行缓冲液（25 mM Tris/HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）
检测原理
CM5 芯片的金表面/羧甲基葡聚糖基质经 EDC/NHS 活化后，用 PDEA 硫醇偶联三甘氨酸连接肽，使表面暴露 (Gly)3 氨基受体。携带 C 端 LPETG 基序的 rFba 与 rSrtA 在含 Ca2+ 缓冲液中发生转肽反应：SrtA 切割 LPETG 并将 rFba 共价连接到表面 (Gly)3，实现 C 端定点固定，使 N 端结合位点暴露。人因子 H（FH）从流动相注入后与 rFba 特异性结合，结合量增加引起芯片表面质量/折射率变化，SPR 共振信号以响应单位（RU）升高；解离时 RU 下降。肝素可竞争抑制 FH 结合，证明识别特异性。该体系无酶放大，直接依赖 SPR 质量响应。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
FH 与固定 rFba 芯片呈浓度依赖结合，浓度覆盖 5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078 μM；解离缓慢，15 min 内下降，7 mg/mL 肝素可完全再生。15 μg/mL 肝素显著抑制 5 μM FH 结合，100 μg/mL 几乎完全抑制，显示选择性。rFba 固定增加 34,600 RU，Gly 连接肽增加 370 RU；无 rSrtA 无增加，说明依赖 SrtA。芯片 4°C 保存 2 个月仍功能。作者主张方法温和、定点、共价，可接受较低纯度蛋白并简化纯化，适合 N 端结合位点蛋白分析。未报告 RSD、回收率或 ELISA/HPLC/qPCR 对比。
传感器的构成
- 基底/换能器：Biacore CM5 传感器芯片，金表面与羧甲基葡聚糖（carboxymethylated dextran）基质，提供 SPR 换能和表面化学偶联位点
- 表面活化/偶联层：EDC/NHS 活化羧基，PDEA（2-(2-pyridinyldithio) ethaneamine）硫醇偶联，引入可连接三甘氨酸连接肽的基团
- 连接肽修饰层：三甘氨酸连接肽 HOOC-Cys-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-NH2，提供 C 端 Gly 作为 SrtA 转肽受体
- 酶促偶联元件：重组金黄色葡萄球菌 sortase A（rSrtA），在 Ca2+ 存在下催化 rFba-LPETG 与表面 (Gly)3 共价连接
- 识别元件：重组链球菌纤维连接蛋白结合蛋白 rFba-LPETG，C 端 LPETG 基序被 SrtA 识别，N 端结合位点暴露以捕获人因子 H
- 封闭/再生剂：L-半胱氨酸封闭多余反应基团；肝素用于再生芯片并去除结合的人因子 H
中文摘要
本文报道了一种利用金黄色葡萄球菌 sortase A（SrtA）转肽酶活性将蛋白定点共价固定到 Biacore 传感器芯片的新方法。Biacore 是基于表面等离子共振（SPR）的实时生物传感器，可分析蛋白结合特异性、动力学和亲和力。作者先在 CM5 芯片的羧甲基葡聚糖表面通过 EDC/NHS 活化和 PDEA 硫醇偶联固定三甘氨酸连接肽，再让携带 C 端 LPETG 基序的重组链球菌纤维连接蛋白结合蛋白 rFba-LPETG 与 rSrtA 在芯片表面反应，实现温和、定向、共价偶联。由于 SrtA 识别 LPXTG 基序高度特异，该方法可接受纯度较低的蛋白样品，简化纯化流程。以人补体因子 H（FH）为分析物验证，FH 与固定 rFba 呈浓度依赖结合，肝素可竞争抑制结合，芯片经肝素再生后 4°C 保存 2 个月仍保持功能。该方法适用于需要 N 端结合位点暴露的蛋白相互作用研究。
英文摘要
The immobilization of proteins to surfaces is an active area of research due to strong interest in protein-based sensors. Here, we describe a novel method for immobilizing ligand proteins onto Biacore sensor chips using the transpeptidase activity of Staphylococcus aureus sortase A (SrtA). This method provides a robust and gentle approach for the site-directed, covalent coupling of proteins to biosensor chips. Notably, the high specificity of the sortase allows immobilization of proteins from less than pure protein samples allowing short cuts in protein purification protocols.