组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Caspase-3活性（caspase-3 activity）；样品基质：HeLa细胞胞质与细胞核（活细胞）
检测原理
该传感器以荧光蛋白FRET为换能机制。供体荧光蛋白（mTFP1或mAmetrine）与受体荧光蛋白（mCitrine或tdTomato）之间插入caspase-3底物DEVD。未切割时，供体发射与受体吸收光谱重叠，发生FRET，受体/供体发射比值较高；caspase-3活性升高后，DEVD被切割，供体与受体距离增大，FRET效率下降，受体/供体比值降低。两套FRET对激发光谱不同，可分别用不同激发波长选择性激发，从而在同一细胞中同时获得核内与胞质的比率信号。信号通过四通道荧光显微镜采集，并以受体/供体强度比反映caspase-3活性。
检测灵敏度
—
效应效果
体外切割后FRET效率为42%和45%，受体/供体发射峰强度比由1.35降至0.55、由0.67降至0.22。HeLa细胞经staurosporine诱导凋亡后，胞质mAmetrine-tdTomato比值在60 min内稳健下降，核内mTFP1-mCitrine比值延迟2.6±1.6 min（17个细胞）下降；非定位表达延迟2.2±1.1 min（11个细胞），双胞质定位同步变化。SASG对照无变化。四通道宽场成像可用商用滤光片实现，交叉激发校正影响不大。作者认为可高精度解析多过程时空动力学。
传感器的构成
- 供体荧光蛋白：mTFP1或mAmetrine，作为FRET供体，分别被蓝绿/紫激发并产生供体发射
- 识别/切割底物：DEVD肽（LGGTGSGSGDEVDG），作为caspase-3特异性切割位点，连接供体与受体
- 受体荧光蛋白：mCitrine或tdTomato，作为FRET受体，切割后FRET效率下降并改变受体/供体比值
- 区室定位元件：核定位或核排除表达序列，使双传感器分别定位于细胞核或胞质
- 对照连接肽：SASG（Ser-Ala-Ser-Gly），不可被caspase-3切割，用作阴性对照
- 光学读出系统：商用带通滤光片与宽场/共聚焦荧光显微镜，实现四通道比率成像
中文摘要
荧光共振能量转移（FRET）结合荧光蛋白是检测细胞内蛋白相互作用、酶活性和小分子的重要方法。受一种新型紫激发黄色荧光蛋白的启发，作者开发了基于双FRET的caspase-3生物传感器。由于两套FRET对具有明显不同的激发光谱，每个FRET生物传感器在另一个存在时均可进行比率成像。文中报道了通过定向进化获得的紫激发黄色荧光蛋白mAmetrine，其激发峰406 nm、发射峰526 nm，可与tdTomato组成FRET对；同时利用mTFP1与mCitrine组成另一FRET对。将caspase-3底物DEVD分别连接于两对荧光蛋白之间，构建mCitrine-DEVD-mTFP1和mAmetrine-DEVD-tdTomato。在HeLa细胞中，两种传感器可分别定位于细胞核和胞质，经staurosporine诱导凋亡后，受体/供体荧光比值发生显著下降，从而实现对caspase-3活性的双通道比率成像。
英文摘要
Fluorescence resonance energy transfer (FRET) with fluorescent proteins is a powerful method for detection of protein-protein interactions, enzyme activities and small molecules in the intracellular milieu. Aided by a new violet-excitable yellow-fluorescing variant of Aequorea victoria GFP, we developed dual FRET-based caspase-3 biosensors. Owing to their distinct excitation profiles, each FRET biosensor can be ratiometrically imaged in the presence of the other.