组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
脂多糖/内毒素（lipopolysaccharide, LPS）、环肽 CLP-19/LALF31–52（亲和传感器分析物）；样品基质：体外缓冲液、小鼠血清
检测原理
本文主要评价 CLP-19 中和 LPS 的活性。在亲和生物传感器方法中，LPS 先固定于疏水比色皿表面，经 PBS/AE 洗涤并用 BSA 封闭后，加入不同浓度 CLP-19 或 LALF31–52。肽分子依靠正电荷与 LPS 脂质 A 磷酸基团的静电吸引，以及疏水残基与脂质 A 脂肪酸链的疏水作用结合到固定 LPS 上；结合量随肽浓度升高而增加，IAsys 亲和传感器记录结合曲线，FASTfit 计算 Kd。LAL 试验中，游离 LPS 激活鲎细胞裂解物引起凝固反应，浊度随游离 LPS 浓度升高而升高；CLP-19 与 LPS 结合后降低游离 LPS，使浊度下降，从而反映中和能力。该过程无额外信号放大，主要依赖直接结合与凝固反应。
检测灵敏度
Kd: CLP-19 8.26 μM；Kd: LALF31–52 47.80 μM
效应效果
CLP-19 在 LAL 试验中以剂量依赖方式中和 LPS，最低和最高浓度下中和率分别超过 65% 和 90%，同浓度下略强于 LALF31–52。亲和传感器显示 CLP-19 的 Kd 为 8.26 μM，低于 LALF31–52 的 47.80 μM，提示更高 LPS 结合亲和力。CLP-19 能剂量依赖抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞释放 TNF-α，MTT 试验未见明显细胞毒性。小鼠内毒素血症模型中，LPS 20 mg/kg 24 h 内致死率 100%；CLP-19 处理后 7 天存活率超过 60%（60–80%），LALF31–52 为 50–80%。血清 TNF-α 抑制率分别为 91.4% 和 87.4%，血清内毒素显著降低。作者认为 CLP-19 是潜在抗 LPS 候选药物。
传感器的构成
- 基底/换能器：疏水比色皿（hydrophobic cuvette, Thermo Labsystem），提供 LPS 固定表面并用于 IAsys 亲和检测。
- 识别/捕获层：LPS（lipopolysaccharide, LPS，2 mg/ml 氯仿溶液）固定于比色皿表面，用于结合肽分子。
- 洗涤缓冲液：PBS/AE（磷酸盐缓冲液含 0.025% 叠氮化钠和 1 mM EDTA），用于清洗非特异结合。
- 封闭层：BSA（bovine serum albumin，5 mg/ml），封闭非特异结合位点。
- 分析物/识别配体：CLP-19（合成环肽）或 LALF31–52（线性对照肽），与固定 LPS 结合。
- 检测仪器：Affinity Sensors IAsys，记录结合曲线并计算 Kd。
中文摘要
内毒素又称脂多糖（LPS），是革兰阴性菌感染所致脓毒性休克的主要介质。近年来，具有 LPS 解毒潜力的阳离子肽受到关注。鲎抗 LPS 因子（LALF）是鲎（Limulus polyphemus）中的一种蛋白，已被证明具有显著抗 LPS 活性。本研究合成了一种环肽 CLP-19，并在体外和体内评价其生物活性。采用鲎细胞裂解物（LAL）试验检测 CLP-19 体外中和 LPS 的能力，并用亲和生物传感器方法测定其 LPS 结合亲和力；以 LALF 第 31–52 位残基合成肽 LALF31–52 作为阳性对照。结果显示，CLP-19 能显著拮抗 LPS，且对小鼠巨噬细胞无明显细胞毒性；CLP-19 可直接结合 LPS，并在 LAL 试验中以剂量依赖方式中和 LPS。此外，CLP-19 还能显著保护小鼠免受致死性 LPS 攻击，并通过降低体内血清 LPS 水平抑制 LPS 诱导的肿瘤坏死因子 α（TNF-α）释放。该研究提示 CLP-19 可作为潜在抗 LPS 药物用于脓毒性休克治疗，值得进一步研究。
英文摘要
Endotoxin, also known as lipopolysaccharide (LPS), is the major mediator of septic shock due to Gram-negative bacterial infections. Recently, much attention has been focused on cationic peptides which possess the potential to detoxify LPS. Limulus anti-LPS factor (LALF), a protein found in the horseshoe crab (Limulus polyphemus), has been proved with striking anti-LPS effects. We synthesized a cyclic peptide (CLP-19), and then investigated its bioactivity both in vitro and in vivo. The ability of CLP-19 to neutralize LPS in vitro was tested using a Limulus amebocyte lysate (LAL) assay and the LPS-binding affinity was measured with an affinity biosensor method. The synthetic peptide LALF31-52 (residues 31 to 52 of LALF) was used as the positive control peptide in this study. It was found that CLP-19 exhibited the significant activity to antagonize LPS without observable cytotoxicity effect on mouse macrophages. CLP-19 directly bound to LPS, and neutralized it in a dose-dependent manner in the LAL assay. Moreover, CLP-19 also showed the remarkable ability to protect mice from lethal LPS attack and to inhibit the LPS-induced tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) release by decreasing serum LPS in vivo. Our work suggests that this peptide is worthy of further investigation as a potential anti-LPS agent in the treatment of septic shock.