组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
RCA120（蓖麻凝集素，Ricinus communis agglutinin）、h-Gal-1（人半乳糖凝集素-1，human galectin-1）；样品基质：HBS-EP缓冲液溶液及含BSA、卵白蛋白、RNase B、胰蛋白酶抑制剂的模型蛋白混合物
检测原理
传感器以金芯片上的混合烷硫醇SAM为界面，11-MUA提供羧基，经EDC/NHS活化后与糖肽的赖氨酸氨基共价偶联，形成固定化碳水化合物识别层。当流动液中的RCA120或h-Gal-1流过时，其碳水化合物结合域与表面糖肽特异性结合，使界面质量增加，改变金表面等离子共振的折射率条件，Biacore 2000记录响应单位（RU）随时间的变化。结合速率或平衡响应随被测物浓度升高而增大，可用初始结合速率dRU/dt或平衡响应Req建立校准。RCA120为二价蛋白，表面多价糖肽可促进二价结合，增强表观亲和力和信号；优化SAM中短羟基硫醇与羧基硫醇的比例可提高配体可及性并降低非特异结合。
检测灵敏度
LOD: 0.13 nM (RCA120, SAM-4/SAM-6)；LOD: 0.65 nM (RCA120, SAM-1/SAM-2)；LOD: 2.6 nM (RCA120, SAM-3)；LOD: 至少0.9 nM (h-Gal-1, SAM-5)
效应效果
优化传感器对RCA120在含10倍和100倍过量BSA、卵白蛋白、RNase B及胰蛋白酶抑制剂的模型混合物中仍保持0.13 nM检测限；1000倍和10000倍过量时因体相效应干扰结合相。对h-Gal-1，等摩尔干扰蛋白不影响信号，10倍过量时结合相末端出现体相偏移但0.9 nM检测限未受影响，50倍和100倍过量时体相效应过强而无法确定检测限。作者认为该灵敏度足以覆盖文献报道的血清半乳糖凝集素水平（约74 pM至32 nM），可用于患者样本中凝集素水平的定量或监测，并可联用质谱或多流路芯片实现多分析物检测。
传感器的构成
- 基底/换能器：金传感器芯片（Au sensor chip，SIA-kit Au），提供SPR换能表面
- 自组装单分子层：混合烷硫醇SAM（11-MUOH/11-MUA或3-MPOH/11-MUA），降低非特异结合并提供羧基锚点
- 偶联活化剂：EDC/NHS，活化11-MUA羧基形成NHS酯用于糖肽共价偶联
- 识别元件：固定化糖肽1（AcA(Gal-)CYPY(Gal-)C-GPPFPFK）或糖肽2（Ac(Lac-)TMRA(Lac-)TCha-GPPFPFK），特异性结合RCA120或h-Gal-1
- 封闭剂：乙醇胺盐酸盐（ethanolamine hydrochloride，pH 8.5），封闭残余NHS酯并降低非特异结合
- 运行缓冲液：HBS-EP（10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% P20、3 mM EDTA，pH 7.5），维持检测环境
- 再生液：200 mM乳糖与0.002% SDS，用于洗脱结合蛋白并再生传感器表面
- 信号读出：Biacore 2000 SPR仪器，监测界面响应单位（RU）变化
中文摘要
本文报道了一种基于表面等离子共振（SPR）的生物传感器，用于在Biacore 2000仪器上检测溶液中的碳水化合物结合蛋白（CBPs）。该传感器以固定化糖肽作为识别配体，糖肽的筛选基于此前利用蓖麻凝集素（RCA120）和人类黏附/生长调控半乳糖凝集素-1（h-Gal-1）对固相糖肽库进行的系统筛选。糖肽被固定化在经混合烷硫醇自组装单分子层（SAM）功能化的金传感器芯片上，混合SAM由不同比例的11-巯基-1-十一碳醇（11-MUOH）与11-巯基十一烷酸（11-MUA），以及3-巯基-1-丙醇（3-MPOH）与11-MUA组成。通过优化SAM组成和配体固定化密度，传感器对RCA120的检测限达到0.13 nM；对h-Gal-1的检测限至少为0.9 nM。研究还考察了干扰蛋白对优化传感器灵敏度的影响，表明该方法可用于溶液中碳水化合物结合蛋白的敏感检测与定量。
英文摘要
The development of a biosensor based on surface plasmon resonance is described for the detection of carbohydrate-binding proteins in solution on a Biacore 2000 instrument, using immobilized glycopeptides as ligands. Their selection was based on previous screenings of solid-phase glycopeptide libraries with Ricinus communis agglutinin (RCA(120)) and human adhesion/growth-regulatory galectin-1 (h-Gal-1). Glycopeptides were immobilized on Au sensor chips functionalized with mixed self-assembled monolayers of different ratios of 11-mercapto-1-undecanol and 11-mercaptoundecanoic acid, and of 3-mercapto-1-propanol and 11-mercaptoundecanoic acid. The biosensors were optimized for the detection of RCA(120), and a detection limit of 0.13 nM was obtained. Subsequent experiments with h-Gal-1 indicated a detection limit of at least 0.9 nM for this lectin. Additionally, the effect of interfering proteins on the sensitivity of the optimized biosensor was investigated.