组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
SARS-CoV 核衣壳蛋白（N protein，重组 His 标签蛋白，HBS-EP 缓冲液）；靶标 RNA 为体外转录 SARS-CoV 5' leader 序列 RNA（HBS-EP 缓冲液）
检测原理
该方法以 SPR 芯片为换能器：生物素化 DNA 探针通过生物素-链霉亲和素作用固定于 SA 芯片，体外转录的 106-nt SARS-CoV RNA 与探针互补区杂交，使 5' leader 序列暴露于溶液侧。当 N 蛋白注入流动池时，其与固定 RNA 结合，使芯片表面质量与折射率增加，SPR 共振角偏移并以共振单位（RU）记录。结合与解离阶段形成传感器图，用 1:1 Langmuir 模型拟合得到 ka、kd 和 Kd。温度升高促进 RNA-DNA 杂交并展开二级结构，提高固定效率；BSA 与非互补寡核苷酸不产生响应，保证识别特异性。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；报告结合亲和力 Kd: 4.60 ± 0.3 nM（37°C），ka: 8.89 ± 0.5 ×10^4 1/ms，kd: 4.12 ± 0.6 ×10^-4 1/s。
效应效果
方法具有良好选择性与稳定性：BSA、oligo dT 及非互补 RNA 均无显著结合或杂交响应；N 蛋白特异性结合 RNA，ssDNA 与 dsDNA 无结合。三次重复 Kd 分别为 4.31、4.61、4.89 nM，平均 4.60±0.3 nM。杂交 RNA 约 95% 具有真实结合活性，37°C 下 5 min 内损失小于 5%。芯片经 20 mM NaOH/1 M NaCl 再生，半年内超过 400 次再生后 RNA 捕获能力仍高于 80%。作者认为该方法比 EMSA 更敏感，可用于筛选 RNA 结合蛋白或肽库。
传感器的构成
- SPR 传感器芯片：Biacore X SA 芯片，提供光学换能与表面固定
- 链霉亲和素（SA）修饰层：固定于芯片葡聚糖基质，捕获生物素化 DNA
- 生物素化 DNA 探针：5'-bio-C6-CTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTT-3'，经生物素-链霉亲和素固定，提供 RNA 杂交位点
- 杂交 RNA 靶标：体外转录 106-nt SARS-CoV RNA，含 5' leader 序列，杂交固定后暴露蛋白结合区
- 验证探针 DNA CR：5'-gcttttcctgggtaggtaaaaacctaatat-3'，检测杂交 RNA 实际活性
- 运行缓冲液 HBS-EP：0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005% P20，pH 7.4，维持杂交与结合
- 再生缓冲液：20 mM NaOH 与 1 M NaCl，去除杂交 RNA 并再生芯片
中文摘要
表面等离子共振（SPR）生物传感器因无需标记、可实时测量生物分子相互作用而具有优势。本文描述了一种在链霉亲和素（SA）修饰传感器芯片表面杂交 RNA 以研究 RNA-蛋白相互作用的方法。通过生物素化 DNA 探针固定于 SA 芯片，体外转录的 SARS-CoV RNA 与探针互补区杂交，使 5' leader 序列暴露于溶液侧；随后将 SARS-CoV 核衣壳（N）蛋白注入 Biacore 系统，实时监测结合与解离动力学。研究证明 N 蛋白与 SARS-CoV 基因组 leader 序列具有较高结合亲和力，并考察温度对 RNA-DNA 杂交的影响。该方法可高灵敏度提供相互作用亲和力，可用于在单一芯片上筛选给定 RNA 靶基序的结合候选分子。
英文摘要
Surface plasmon resonance (SPR) biosensor is a promising technology for its various advantages including the real-time measurement of biomolecular interactions without labeling. A method of hybridizing RNAs on the surface of the streptavidin-coated (SA) sensor chip to study RNA-protein interactions was described in this paper. In our study, it has been shown that the nucleocapsid (N) protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) has a high binding affinity for the leader sequence of SARS-CoV genome. Effect of temperature on the RNA-DNA hybridization was also examined. This method can provide the affinity of interactions with high sensitivity. Therefore, it will be useful in screening binding candidates for a given RNA target motif with one chip.