组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）；样品基质：活细胞（HeLa、RAW264.7、原代人T细胞）的细胞质与线粒体
检测原理
Grx1-roGFP2 由人 glutaredoxin-1（Grx1）与 roGFP2 经柔性连接肽融合而成。Grx1 通过单硫醇机制识别 GSSG，形成蛋白-谷胱甘肽混合二硫键中间体，并进一步将 roGFP2 中的人工二硫醇-二硫键对氧化；GSH 则通过还原反应使传感器回到还原态。roGFP2 的氧化态与还原态具有不同激发/发射光谱，因此 405/488 或 390/480 nm 激发下的发射比率随 EGSH 变化。由于 roGFP2 中点电位约 -280 mV，比生理 GSH/GSSG 电位更负，GSSG 的纳摩尔级增加即可引起传感器氧化度大幅变化。Grx1 催化使平衡速率较未融合 roGFP2 提高至少 100,000 倍，并赋予 GSH/GSSG 特异性；H2O2 经 GPX 氧化 GSH 生成 GSSG，间接放大氧化信号。
检测灵敏度
可检测纳摩尔级 GSSG 变化（背景为毫摩尔 GSH）；低微摩尔 H2O2 可诱发响应；最大比率变化约 4.4；Grx1 催化使氧化速率较未融合 roGFP2 快至少 100,000 倍。
效应效果
Grx1-roGFP2 对 GSH/GSSG 选择性良好，对多种非谷胱甘肽氧化还原物不响应；pH 5.5–8.5 内比率不敏感，Trx 系统不干扰。其氧化速率较未融合 roGFP2 快至少 100,000 倍，最大比率变化约 4.4，高于 HyPer 的约 2.4，对低微摩尔 H2O2 响应不弱于 HyPer。可检测生长因子剥夺使 EGSH 从约 -300 到 -280 mV 氧化，细胞密度增加 5 倍使 EGSH 从约 -280 到 -320 mV 还原；TRAIL 凋亡中，线粒体 EGSH 去极化后 15 min 内最大氧化，细胞质延迟 15–20 min 后从约 -290 升至 -240 mV。PMA 刺激 RAW264.7 和 T 细胞受体刺激分别显示呼吸爆发与约 75% 氧化，作者认为可用于药物筛选与毒理学。
传感器的构成
- 表达基质：HeLa、RAW264.7 及原代人T细胞，提供传感器表达与成像环境。
- 融合蛋白骨架：Grx1-roGFP2 融合蛋白，作为遗传编码氧化还原传感器主体。
- 连接肽：30氨基酸间隔肽（Gly-Gly-Ser-Gly-Gly）6，连接 Grx1 与 roGFP2，提供柔性。
- 识别催化元件：人 glutaredoxin-1（Grx1），催化 GSH/GSSG 与 roGFP2 氧化还原平衡，赋予谷胱甘肽特异性。
- 报告换能元件：roGFP2（redox-sensitive GFP2），含人工二硫醇-二硫键对，氧化还原状态改变引起激发/发射比率变化。
- 靶向序列：Neurospora crassa ATP合酶蛋白9信号肽，用于将 mito-Grx1-roGFP2 定位至线粒体基质。
- 信号读出系统：共聚焦显微镜或流式细胞仪，双激发波长比率荧光（405/408/488 nm 激发，500–530/500–554 nm 发射）。
中文摘要
活细胞中氧化还原过程的动态分析长期受限于缺乏合适的氧化还原生物传感器。传统氧化还原敏感绿色荧光蛋白（roGFP）存在特异性不明确、对氧化还原电位变化响应缓慢等局限。本研究证明，将人 glutaredoxin-1（Grx1）与 roGFP2 融合，可促进传感器蛋白与谷胱甘肽氧化还原对之间发生特异、实时的氧化还原平衡。Grx1-roGFP2 融合蛋白能够在不同细胞区室中以高灵敏度和时间分辨率动态活体成像谷胱甘肽氧化还原电位（EGSH）。该生物传感器可在毫摩尔还原型谷胱甘肽（GSH）背景下检测纳摩尔氧化型谷胱甘肽（GSSG）的变化，时间尺度为秒至分钟。它使研究者能够观察与生长因子可用性、细胞密度、线粒体去极化、呼吸爆发活性及免疫受体刺激相关的氧化还原变化。
英文摘要
Dynamic analysis of redox-based processes in living cells is now restricted by the lack of appropriate redox biosensors. Conventional redox-sensitive GFPs (roGFPs) are limited by undefined specificity and slow response to changes in redox potential. In this study we demonstrate that the fusion of human glutaredoxin-1 (Grx1) to roGFP2 facilitates specific real-time equilibration between the sensor protein and the glutathione redox couple. The Grx1-roGFP2 fusion protein allowed dynamic live imaging of the glutathione redox potential (E(GSH)) in different cellular compartments with high sensitivity and temporal resolution. The biosensor detected nanomolar changes in oxidized glutathione (GSSG) against a backdrop of millimolar reduced glutathione (GSH) on a scale of seconds to minutes. It facilitated the observation of redox changes associated with growth factor availability, cell density, mitochondrial depolarization, respiratory burst activity and immune receptor stimulation.