组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
磺脲类药物（SUs：格列本脲 GLB、醋己脲 ACT、甲苯磺丁脲 TOL、格列吡嗪 GLP）；cAMP；样品基质：HEK293T活细胞培养液（Hanks平衡盐溶液）、细胞裂解液及体外纯化蛋白缓冲液。
检测原理
FRET生物传感器由Cerulean-Epac2-Venus融合蛋白构成。磺脲类药物（SUs）直接结合Epac2中由R447和F374等残基形成的变构位点，诱导hinge区构象变化，解除对Rap1结合界面的自抑制；cAMP结合CNB域也通过类似hinge运动激活Epac2。构象变化改变Cerulean与Venus的距离/取向，使435 nm激发下FRET效率降低，Cerulean/Venus发射比升高。SU浓度越高，FRET降低越明显，GLP可产生最大响应。Epac2激活后促进Rap1 GTP交换，Raichu-Rap1探针FRET改变，并进一步激活ERK1/2，形成酶级联生物放大。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该FRET方法在活细胞中区分SU与cAMP作用：AKAR显示GLB/ACT不升高cAMP。SU选择性激活Epac2而不激活Epac1；R447A几乎消除GLB响应（0.7±0.8%对WT 7.6±1.3%），但保留cAMP响应（12.1±4.9%）。L426W hinge突变同时降低SU与cAMP响应。GLP单独产生最大Epac2响应，GLB/ACT/TOL后Fsk/IBMX仍可升高（5.2±1.8%、5.8±2.0%、10.5±1.8%）。5 μM GLB和750 μM ACT诱导pERK1/2接近cAMP。较免疫印迹可实时单细胞监测，作者认为SU是新型亚型选择性酶激活剂，为Epac2选择性药物设计提供依据。
传感器的构成
- 表达基质：HEK293T细胞，作为活细胞表达与成像基底。
- 融合蛋白骨架：Cerulean-Epac2-Venus，由pcDNA3.1载体表达，承载传感与荧光元件。
- 识别/传感元件：全长Epac2（结合SU/cAMP）及Raichu-Rap1（Rap1激活探针），发生构象变化。
- 供体荧光标记：Cerulean（CFP变体），作为FRET供体，435 nm激发、475 nm发射。
- 受体荧光标记：Venus（YFP变体），作为FRET受体，535 nm发射。
- 辅助表达标记：mCherry融合Epac2，用于表达对照和下游pERK1/2实验。
- 信号读出：435 nm激发下Cerulean/Venus双发射比（475/535 nm），FRET降低表现为蓝/黄发射比升高。
中文摘要
磺脲类药物（SUs）是治疗2型糖尿病的常用口服药，传统上通过结合磺脲类受体（SUR）刺激胰岛β细胞分泌胰岛素。近期研究发现SUs还可激活cAMP直接激活的交换蛋白2（Epac2），但其分子机制尚不清楚。本研究利用FRET荧光生物传感器成像和生化分析，证明SUs通过直接结合Epac2激活该蛋白及其下游信号。突变分析与分子对接鉴定出Epac2的R447残基在SU结合中起关键作用，该位点不同于cAMP结合位点，提示SU以新的变构方式激活Epac2。进一步实验显示，SUs选择性激活Epac2亚型，而不激活结构相近的Epac1，从而将SUs确立为一类新的亚型选择性酶激活剂。
英文摘要
Commonly used as a treatment for Type II diabetes, sulfonylureas (SUs) stimulate insulin secretion from pancreatic β cells by binding to sulfonylurea receptors. Recently, SUs have been shown to also activate exchange protein directly activated by cAMP 2 (Epac2), however, little is known about this molecular action. Using biosensor imaging and biochemical analysis, we show that SUs activate Epac2 and the downstream signaling via direct binding to Epac2. We further identify R447 of Epac2 to be critically involved in SU binding. This distinct binding site from cAMP points to a new mode of allosteric activation of Epac2. We also show that SUs selectively activate Epac2 isoform, but not the closely related Epac1, further establishing SUs as a new class of isoform-selective enzyme activators.