组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
BPDE（(±)-trans-7,8-二羟基-anti-9,10-环氧-7,8,9,10-四氢苯并[a]芘）及其与AcGFP1基因形成的BPDE–AcGFP1加合物；样品基质：体外DNA片段/重组质粒及HEK 293细胞培养体系
检测原理
该方法以AcGFP1基因片段为直接传感元件，将不含质粒骨架的766 bp DNA暴露于BPDE。BPDE作为亲电代谢物与DNA共价结合，形成BPDE–AcGFP1加合物，造成模板损伤并干扰复制、转录或测序过程中的聚合。加合物浓度越高，AcGFP1基因在HEK 293细胞中的表达越受抑制，GFP蛋白合成减少，其内源荧光强度随之下降。信号换能不依赖外源底物或电极，而是由真核细胞将DNA加合物信息转化为GFP荧光变化；流式细胞术FL1-H通道和共聚焦显微镜分别提供单细胞荧光定量与成像，UV 346 nm吸收则用于加合物定量。
检测灵敏度
线性范围: 0–8.59 μM（BPDE–AcGFP1加合物）；R^2 = 0.9918（流式细胞术）；R^2 = 0.9324（共聚焦显微镜）
效应效果
与整个质粒或细胞培养物处理相比，仅处理目标AcGFP1基因可避免BPDE加合物形成于质粒骨架，从而消除目标基因表达假阴性。流式细胞术显示G1a–G1d加合物使GFP表达差异分别为2.47、11.19、16.49和23.71，R^2=0.9918；共聚焦平均荧光强度由对照40.83降至G1d的20，R^2=0.9324。质粒骨架加合物P1也引起4.77–20.74的表达差异（R^2=0.9941），说明全质粒处理会误导结果。三次转染重复给出误差棒/标准差。作者认为该方法快速、直接、简单，可用于致突变物筛选和准确浓度判定。
传感器的构成
- 传感基因层：AcGFP1基因片段（766 bp），作为直接识别/传感元件，与BPDE形成加合物
- 表达载体层：pAcGFP-N1穿梭载体（4.7 kb），用于重新连接加合AcGFP1基因并驱动真核表达
- 宿主细胞层：HEK 293人胚胎肾细胞，作为真核复制与表达平台
- 信号报告层：AcGFP1编码的绿色荧光蛋白（GFP），以荧光强度反映基因表达变化
- 分析物：BPDE（(±)-trans-7,8-二羟基-anti-9,10-环氧-7,8,9,10-四氢苯并[a]芘），与AcGFP1共价结合
- 转染层：Lipofectamine 2000，将重组质粒导入HEK 293细胞
- 加合物定量层：紫外吸收光谱（346 nm，ε=29,000 M^-1 cm^-1），测定BPDE–DNA加合物摩尔浓度
- 读出层：流式细胞仪（FL1-H）与Olympus IX71共聚焦显微镜，进行单细胞荧光定量与成像
中文摘要
本研究开发了一种以绿色荧光蛋白（GFP）作为直接生物传感器检测突变的新方法，用于评估可疑致突变物的致突变效力。作者以苯并[a]芘高反应性亲电代谢物(±)-7β,8α-二羟基-9α,10α-环氧-7,8,9,10-四氢苯并[a]芘（BPDE）为模型致突变物，将不含质粒骨架的目标AcGFP1基因片段暴露于10–500 μM BPDE，形成不同浓度的BPDE–AcGFP1加合物（0–8.59 μM），再将其重新连接至pAcGFP-N1穿梭载体并转染真核宿主细胞。与传统对整个质粒或细胞培养物进行致突变物处理不同，该方法避免加合物形成于残余质粒骨架或其他细胞组分，从而消除目标基因表达中的假阴性误差，并无需额外融合基因。通过紫外光谱定量加合物，并用流式细胞术和共聚焦显微镜监测AcGFP1基因表达及GFP荧光变化，结果显示GFP表达随BPDE–AcGFP1加合物浓度增加而线性下降，验证了GFP作为突变检测直接生物传感器的高效性和直接性。
英文摘要
A new method was developed to determine the mutagenic efficacy of a suspected mutagen by employing green fluorescent protein (GFP) as a direct biosensor for mutation detection. Alterations in target gene (AcGFP1) expression after mutagen [(+/-)-7p,8a-dihydroxy-9a,10a-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyrene (BPDE)] treatment were measured to detect the mutagenic efficacy of the carcinogen. In contrast to mutagen treatment of the entire plasmid or cell culture, the target AcGFP1gene devoid of the plasmid backbone was exposed to BPDE (10-500 microM) to eliminate the need for an additional fusion gene. Shuttle vectors (pAcGFP-N1) were religated to the AcGFP1 gene with BPDE adducts (0-8.59 microM) and replicated in the eukaryotic host. This approach eliminated false-negative errors in target gene expression that arose from BPDE adduct formation in the residual plasmid backbone rather than in the AcGFP1 gene. Determination of the BPDE-AcGFP1 adducts allowed the quantitative mutagenic effect of the BPDE adducts on AcGFP1 gene expression to be monitored. The results obtained with flow cytometry and confocal microscopy validate our method and demonstrate efficient and direct use of GFP as a biosensor for mutation detection.