组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
单链DNA（ssDNA）；DNA解旋酶活性（helicase activity，PcrA/RepD、RecBCD、AddAB）；样品基质：体外缓冲液中的质粒DNA解旋反应体系
检测原理
DCC-SSB 探针由大肠杆菌 SSB G26C 突变体与香豆素 DCC 共价标记构成。游离 DCC-SSB 的香豆素处于低荧光状态（量子产率约0.03）。当解旋酶在 ATP 驱动下将 dsDNA 解旋生成 ssDNA 时，ssDNA 快速结合 SSB 四聚体并包裹蛋白表面，改变 DCC 微环境，降低非辐射衰减，使荧光增强约6倍（量子产率约0.15）。在 SSB 过量（约1个单体对应5个核苷酸）条件下，荧光强度随 ssDNA 浓度近似线性增加。停流或荧光计以 430/436 nm 激发、455/475 nm 发射实时监测，从而将 ssDNA 生成量转换为荧光信号。该法无需外源酶或纳米放大，依靠高亲和、快速结合（约10^9 M^-1 s^-1）和6倍荧光增强实现高灵敏度。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2；表观 Kd: ~2.6 nM；荧光增强: ~6-fold；结合速率: ~10^9 M^-1 s^-1
效应效果
DCC-SSB 对 ssDNA 高度特异：天然 Lambda dsDNA 无响应，热变性后产生接近完整荧光增强；ssRNA 和 poly(U) 基本无响应。与内源色氨酸荧光相比，灵敏度提高1–2个数量级，并避免光漂白和紫外背景干扰。50 nM（核苷酸）底物单条曲线仍具良好信噪比，可检测低纳摩尔 ssDNA。与染料置换法比较，AddAB 解旋在低盐下最大观测速率为 400 nM ntds/s（约1000 bp/s/结合位点），高盐为 85 nM ntds/s；染料置换法为 340 和 110 nM ntds/s，曲线趋势一致。RecBCD 解旋速率约1700 bp/s/结合位点，与文献一致。作者认为该探针适用于批量、高通量或单分子水平研究 ssDNA 中间体。
传感器的构成
- 基底/换能器：无固定电极或纳米基底，采用溶液相荧光检测（Tris-HCl/NaCl/DTT/BSA 缓冲液 + 荧光计/停流）
- 识别元件：大肠杆菌单链DNA结合蛋白 SSB G26C 突变体四聚体，特异性结合 ssDNA 并区分 dsDNA/RNA
- 信号标记物：香豆素 DCC（由 IDCC 共价标记 G26C 半胱氨酸），结合 ssDNA 后荧光增强约6倍
- 样品/反应介质：双链DNA底物（pCERoriD、pADGF0、pBR322）与解旋酶（PcrA/RepD、RecBCD、AddAB）及 ATP，用于产生 ssDNA 中间体
中文摘要
单链DNA（ssDNA）的形成与维持是复制、转录、修复和重组等DNA过程的关键环节。DNA解旋酶通过耦合ATP水解催化双链DNA（dsDNA）解链，使碱基暴露并进一步加工。为理解相关生物学过程，需要能够实时、高灵敏地监测解旋酶活性及其机制的探针。本文报道了一种无试剂荧光生物传感器的开发与应用，该传感器基于大肠杆菌单链DNA结合蛋白（SSB），并在特定位点共价标记香豆素荧光团。DCC-SSB 探针在结合 ssDNA 时发生约6倍荧光增强，对 dsDNA 和 RNA 基本无响应，且结合动力学快速，可用于实时检测 ssDNA 生成。作者将该探针用于 PcrA/RepD、RecBCD 和 AddAB 等 DNA 解旋酶催化的 DNA 解旋反应，展示了其在高时间分辨率下监测长片段 dsDNA 解旋和 ssDNA 中间体形成的能力，为研究涉及 ssDNA 的 DNA 加工过程提供了灵敏、通用的检测工具。
英文摘要
The formation and maintenance of single-stranded DNA (ssDNA) are essential parts of many processes involving DNA. For example, strand separation of double-stranded DNA (dsDNA) is catalyzed by helicases, and this exposure of the bases on the DNA allows further processing, such as replication, recombination, or repair. Assays of helicase activity and probes for their mechanism are essential for understanding related biological processes. Here we describe the development and use of a fluorescent probe to measure ssDNA formation specifically and in real time, with high sensitivity and time resolution. The reagentless biosensor is based on the ssDNA binding protein (SSB) from Escherichia coli, labeled at a specific site with a coumarin fluorophore. Its use in the study of DNA manipulations involving ssDNA intermediates is demonstrated in assays for DNA unwinding, catalyzed by DNA helicases.