组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
蛋白结合异肽（protein-bound isopeptides；BSA-异肽偶联物 BSA-isopeptide）；样品基质：HBS 缓冲液、1% 人血浆
检测原理
将抗异肽单克隆 IgM 抗体 81D4 通过 EDC/NHS 胺偶联共价固定于 CM5 羧甲基化葡聚糖表面，并用乙醇胺封闭。样品中的蛋白结合异肽（BSA-异肽）与固定抗体特异性结合，形成表面免疫复合物。结合导致传感器表面质量增加，引起局部折射率变化，SPR 共振条件改变，仪器以共振单位（RU）随时间记录传感器图。结合量随异肽浓度增加而增加，在低浓度区呈线性响应；解离或 HCl 再生后表面可重复使用。该方法无需标记，直接实时监测免疫捕获。
检测灵敏度
LOD: about 20 nM；线性范围: 23–186 nM
效应效果
固定 81D4 响应为 12,000–15,000 RU（12–15 ng/mm2），对照 IgM 为 6300 RU。81D4 与 BSA-异肽表观亲和力约 4×10^-7 M。缓冲液和 1% 人血浆中 23–186 nM 呈线性，灵敏度限约 20 nM；血浆斜率较缓冲液平缓，可能因异肽与血浆蛋白轻微相互作用。以小鼠 IgM 参考通道扣除后，未见血浆成分显著非特异吸附，BSA 无结合，未检测到血浆交叉反应。加标血浆中异肽量与 SPR 响应适当相关。pH 3.5 HCl 再生可重复使用，但有少量积累。作者认为该方法有望发展为快速灵敏的 SPR 免疫测定，用于疑似脓毒症患者血浆天然异肽交联早期检测。
传感器的构成
- 基底/换能器：商用 SPR 芯片（CM5 芯片），提供表面等离子共振光学换能
- 修饰层：羧甲基化葡聚糖（CM5）水凝胶层，提供羧基官能团并增大相互作用面积
- 偶联试剂：EDC/NHS 胺偶联体系，活化羧基并与抗体氨基共价结合
- 识别元件：单克隆 IgM 抗体 81D4，特异性识别蛋白结合异肽交联并捕获分析物
- 封闭剂：1 M 乙醇胺（ethanolamine），封闭未反应羧基，降低非特异吸附
- 参考通道：阴性对照小鼠 IgM 固定于另一流路，用于扣除非特异信号
中文摘要
本研究证明，在牛血清白蛋白（BSA）上形成的合成异肽可通过基于表面等离子共振（SPR）的生物传感器方法进行定量分析。能与合成异肽及 D-二聚体中天然异肽交联反应（但不与非交联纤维蛋白单体反应）的单克隆 IgM 抗体 81D4 被共价固定于羧甲基化葡聚糖（CM5）表面，其免疫捕获效率良好。81D4 与合成异肽相互作用的亲和力估计约为 4×10^-7 M。当使用加入该异肽的人血浆作为测试液时，也观察到良好反应性。血浆中交联 D-二聚体是弥散性血管内凝血（DIC）的标志，而 DIC 常发生于脓毒症晚期。该生物传感器方法有望发展为快速、灵敏的检测方法，用于测定疑似脓毒症患者血浆中蛋白质天然异肽交联水平。
英文摘要
This study demonstrates that synthetic isopeptides formed on BSA can be quantitatively analyzed by a surface plasmon resonance-based biosensor method. A monoclonal IgM antibody 81D4, that reacts with the synthetic isopeptide and also with the natural isopeptide cross-link in D-dimer (but not with its non-cross-linked fibrin monomer), was covalently immobilized to a carboxymethylated dextran surface, a CM5 surface. Its immunocapturing efficiency was found to be good. The affinity of the interaction between the monoclonal 81D4 and the synthetic isopeptide was estimated to approximately 4x10(-7)M. Good reactivity was also observed when human plasma spiked with this isopeptide was used as test solution. Cross-linked D-dimer in the plasma of patients is a marker of disseminated intravascular coagulation (DIC) which occurs late in sepsis. This biosensor method has the potential to be developed into a rapid sensitive assay for measuring the level of natural isopeptide cross-links in proteins in the plasma of patients with a suspected diagnosis of sepsis.