组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞内氯离子（intracellular chloride, [Cl]i）、甘氨酸（glycine）/甘氨酸受体通道活性（GlyR activity）；样品基质：大鼠视网膜切片、HEK-293、CHO-K1、BHK-21 细胞
检测原理
Cl-Sensor 由 CFP 与 YFP 融合而成，YFP 荧光团与 Cl- 结合后发生荧光淬灭和激发光谱位移，CFP 对 Cl- 不敏感，作为内参。通过 440 nm 与 480 nm 交替激发并计算 F480/F440 比率，可比率读出 [Cl]i；Kapp≈30 mM，接近生理范围。高 K+ 去极化使 Cl- 内流，[Cl]i 升高，比率随之改变。BioSensor-GlyR 将 Cl-Sensor 插入 GlyR α1 胞内长环，甘氨酸结合受体外域后通道开放，Cl- 沿电化学梯度流入，通道附近胞质 Cl- 局部升高，使 Cl-Sensor 荧光变化。荧光变化幅度与甘氨酸诱导电流近似线性，因此可直接光谱监测受体门控通道活性。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；报告 Cl-Sensor Kapp≈30 mM；GlyR 甘氨酸 EC50：野生型 30–210 mM，BioSensor-GlyR 70–300 mM。
效应效果
Cl-Sensor 经体内电穿孔在大鼠视网膜表达，表达可维持超过一个月，光感受器中 P6 [Cl]i 为 51±2 mM，P16 为 31±1 mM，P21 为 36±1 mM；40 mM KCl 去极化使 [Cl]i 升高 43±3 mM，低 Cl- 溶液中仅 4±1 mM，显示 Cl- 依赖性和可逆性。BioSensor-GlyR 保留野生型 GlyR 的动力学、甘氨酸 EC50（野生型 30–210 mM，BioSensor-GlyR 70–300 mM）和 Cl- 选择性，反转电位接近 ECl。甘氨酸诱导电流与荧光变化近似线性，约 300 pA 电流即可产生可检测荧光。作者认为其可用于药物筛选、生理/病理 Cl- 监测及受体通道活性光谱监测。
传感器的构成
- 基因模板/表达载体：Cl-Sensor cDNA 或 BioSensor-GlyR cDNA，含 CMVie 启动子，用于在细胞内表达荧光探针或嵌合受体
- 细胞基底/微环境：大鼠视网膜切片、HEK-293、CHO-K1、BHK-21 细胞，提供膜、胞质及 Cl- 微环境
- 膜定位识别元件：人源 α1 亚基甘氨酸受体（GlyR）胞内长环，结合甘氨酸并介导 Cl- 通道开放，同时锚定 Cl-Sensor
- 离子识别/荧光换能元件：CFP–YFP 融合蛋白 Cl-Sensor，YFP 荧光团结合 Cl- 后激发光谱改变，CFP 作为参考
- 信号标记物：Cl-Sensor 的 CFP 与 YFP 荧光团，产生 440/480 nm 激发比率（F480/F440）变化
- 递送/转染系统：Lipofectamine 2000、Magnetofection CombiMag 或 in vivo 电穿孔，将 cDNA 导入细胞
中文摘要
基因编码探针已成为非侵入监测离子、蛋白分布及细胞组分迁移与形成的有力工具。本文报道两种分子探针的功能表达，用于非侵入荧光监测胞内氯离子浓度（[Cl]i）和甘氨酸受体（GlyR）通道功能。第一种为近期开发的蓝荧光蛋白–黄荧光蛋白（CFP–YFP）融合探针 Cl-Sensor，对 Cl- 具有较高敏感性（Kapp≈30 mM）。作者通过体内电穿孔将其表达于视网膜细胞，并分析去极化及出生后三周内 [Cl]i 的变化。40 mM KCl 处理使 [Cl]i 升高约 40 mM；P6 大鼠视网膜光感受器平均 [Cl]i 约 50 mM，P16 和 P21 约 30–35 mM。第二种构象 BioSensor-GlyR 是将 Cl-Sensor 插入 GlyR 胞内结构域的通道蛋白，是首个用于光谱监测受体门控通道功能的分子探针。此类探针可用于药物筛选，并在不同生理和病理条件下监测 Cl- 及异源系统与神经元中 GlyR 活性。
英文摘要
Genetically encoded probes have become powerful tools for non-invasive monitoring of ions, distributions of proteins and the migration and formation of cellular components. We describe the functional expression of two molecular probes for non-invasive fluorescent monitoring of intracellular Cl ([Cl]i) and the functioning of glycine receptor (GlyR) channels. The first probe is a recently developed cyan fluorescent protein-yellow fluorescent protein-based construct, termed Cl-Sensor, with relatively high sensitivity to Cl (Kapp approximately 30 mM). In this study, we describe its expression in retina cells using in vivo electroporation and analyse changes in [Cl]i at depolarization and during the first three weeks of post-natal development. An application of 40 mM K+ causes an elevation in [Cl]i of approximately 40 mM. In photoreceptors from retina slices of a 6-day-old rat (P6 rat), the mean [Cl]i is approximately 50 mM, and for P16 and P21 rats it is approximately 30-35 mM. The second construct, termed BioSensor-GlyR, is a GlyR channel with Cl-Sensor incorporated into the cytoplasmic domain. This is the first molecular probe for spectroscopic monitoring of the functioning of receptor-operated channels. These types of probes offer a means of screening pharmacological agents and monitoring Cl under different physiological and pathological conditions and permit spectroscopic monitoring of the activity of GlyRs expressed in heterologous systems and neurons.